Вплив ω-3 поліненасичених жирних кислот на структурні зміни коннексину-43 при стрептозотоцин-індукованому цукровому діабеті.
•
1 j'aime•725 vues
Recommandé
Вплив ω-3 поліненасичених жирних кислот на структурні зміни коннексину-43 при стрептозотоцин-індукованому цукровому діабеті.
- 1. Інститут фізіології імені О. О. Богомольця Відділ загальної та молекулярної патофізіології Вплив ω-3 поліненасичених жирних кислот на структурні зміни коннексину-43 при стрептозотоцин-індукованому цукровому діабеті . Науковий керівник – Академік НАН України Мойбенко Олексій Олексійович Доповідач: аспірантка Жуковська Анна Сергіївна 1
- 2. Конференція молодих вчених «Фізіологія: від молекул до організму», 20-21 жовтня 2011 року intracellular s. pl. membrane extrac. space pl. membrane intracellular s. connexon (hemichannel) connexin pore Коннексини - це спеціалізовані мембранні білки, які, згруповуючись, утворюють канали між цитоплазмами двох суміжних клітин (коннексон). У щілинних контактах між кардіоміоцитами шлуночка серця експресується переважно коннексин-43 (Сх43), який забезпечує передачу електричного сигналу по серцю. При стрептозотоцин-індукованому діабеті спостерігається порушення розподілу і локалізації Сх43, що може корелювати з погіршенням серцевої провідності. Відомо, що ω-3 поліненасичені жирні кислоти (ПНЖК) покращують функціонування серця за умов різноманітної серцево-судинної патології. Грунтуючись на даних літератури припускаємо зміни розподілу і локалізації Сх43 в серці за умов експериментального діабету на фоні вживання ω-3 ПНЖК. Жуковська А. С., відділ загальної та молекулярної патофізіології, 2011 2
- 3. Конференція молодих вчених «Фізіологія: від молекул до організму», 20-21 жовтня 2011 року Мета, матеріали і методи МЕТА: дослідити вплив ω-3 ПНЖК (препарат “Епадол”) на розподіл і локалізацію Сх43, виявленого в структурах серця і аорти при моделюванні експериментального цукрового діабету (ЦД). МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ: Для досліду використано щурів самців, яких розподілено на 3 групи:1 – контрольну, n=7 2 – щурів зі стрептозотоцин-індукованим (50 мг/кг) цукровим діабетом (ЦД), n=7, 3 – щурів, які після підтвердження стрептозотоцин-індукованого ЦД протягом 4 тиж отримували ω-3 ПНЖК, n=7 (препарат «Епадол», 0,1 мл/100 г маси тіла щура) (містить 43% суми ДГК та ЕПК). Жуковська А. С., відділ загальної та молекулярної патофізіології, 2011 3
- 4. Залежність показників маси тіла і рівню глюкози щурів при експериментальному ЦД і вживанні ω-3 ПНЖК 232,85 250 219,7 ** 200 177,5 150 Масса тела крысы, г 100 Глюкоза, мМ/л 50 33 * 19,2 ** 7,8 0 І группа ІІ группа ІІІ группа Примітка: * - вірогідно у порівнянні з контролем, ** - вірогідно у порівнянні з цукровим діабетом; Р<0,05 Жуковська А. С., відділ загальної та молекулярної патофізіології, 2011 4
- 5. Діаграма 1. Вміст α-ліноленової та арахідонової кислот в гомогенаті тканини міокарда щурів експериментальних груп α-ліноленова, ω-3 ПНЖК Арахідонова, ω-6 ПНЖК 1,4 45 1,2 40 * 35 1 30 ** 0,8 І група І група 25 ІІ група ІІ група 0,6 20 ІІІ група ІІІ група 15 0,4 10 0,2 5 0 0 Примітка: * - вірогідно у порівнянні з контролем, ** - вірогідно у порівнянні з цукровим діабетом; Р<0,05 Жуковська А. С., відділ загальної та молекулярної патофізіології, 2011 5
- 6. Імуногістохімія виявлення Сх43 в тканині лівого шлуночка тварин дослідних груп КМЦ 5 * КМЦ 4 3 2 Сх 43 Сх 43 1 0 І група ІІ група ІІІ група А С Примітка: А - контроль, В – група ЦД, С – прийом ω-3 ПНЖК Сх 43 – коннексин 43, КМЦ – кардіоміоцит; збільшення Х40, Сх 43 * - вірогідно у порівнянні з контролем, ** - вірогідно у порівнянні з цукровим діабетом; КМЦ В Р<0,05 6 Жуковська А. С., відділ загальної та молекулярної патофізіології, 2011
- 7. Діаграма 3. Зміни експресії Сх43 в тканині лівого шлуночка щурів експериментальних груп, неопубліковані дані Шиш А. М. 2,0 * 1,8 ** 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 І ІІ ІІІ 0,4 0,2 0,0 1 2 3 І група ІІ група ІІІ група Примітка: * - вірогідно у порівнянні з контролем, ** - вірогідно у порівнянні з цукровим діабетом; Р<0,05 Жуковська А. С., відділ загальної та молекулярної патофізіології, 2011 7
- 8. Імуногістохімія виявлення Сх43 в тканині аорти тварин Сх 43 дослідних груп А Сх 43 Число імунорективних частинок / 1 мм2 ендотелію 80000 С 70000 Примітка: 60000 50000 А - контроль, В – група ЦД, С – прийом ω-3 ПНЖК 40000 Сх 43 – коннексин 43 30000 20000 10000 0 Число імунорективних частинок / 1мм2 середньої оболонки Площа ІФ реакції / Площа виміряної тканини в аорті (E+СО) 90 000 80 000 Сх 43 5,00000 70 000 4,50000 4,00000 60 000 # 3,50000 50 000 3,00000 K 40 000 2,50000 STZ % # STZ+FO 2,00000 * 30 000 ## 1,50000 20 000 1,00000 8 10 000 B 0,50000 0,00000 0
- 9. Конференція молодих вчених «Фізіологія: від молекул до організму», 20-21 жовтня 2011 року Висновки Додавання ω-3 ПНЖК до раціону щурів статистично значимо попереджувало зниження маси тіла і призвело до зниження рівня глюкози крові у тварин з експериментальним ЦД . Виявлено, що за допомогою ω-3 ПНЖК відбувається модифікація жирнокислотного складу гомогенату тканини міокарда. За результатами імунофлуоресцентного аналізу при ЦД спостерігається порушення розподілу, дезорганізація і латералізація коннексину-43, зміна числа імунореактивних частинок коннексину-43 у вставних дисках, порівняно з контролем. Отримання щурами ω-3 ПНЖК сприяло нормалізації розподілу коннексину-43 при експериментальному ЦД, а число імунореактивних частинок коннексину-43 наблизилось до контрольних значень. Отже, застосування ω-3 ПНЖК покращує структурні зміни коннексину-43 в серці та аорті, викликані ЦД і можуть бути корисними у зниженні ризику серцево-судинних ускладнень за цієї патології. Жуковська А. С., відділ загальної та молекулярної патофізіології, 2011 9
- 10. Конференція молодих вчених «Фізіологія: від молекул до організму», 20-21 жовтня 2011 року Виражаємо глибоку подяку співробітникам Інституту серця САН, де частково виконувалась робота: •Трібуловій Нарціс •Округліцовій Людмилі •Беновій Тамарі Щиро дякую за допомогу в роботі співробітникам Інституту фізіології НАНУ: Мойбенко Олексію Олексійовичу Скібо Галині Григорівні Шиш Анжелі Михайлівні Брюзгіній Тетяні Семенівні Жуковська А. С., відділ загальної та молекулярної патофізіології, 2011 10
- 11. 11
Notes de l'éditeur
- Доброго дня, шановн ий головуючий, присутні! Я вдячна організаторам за надану мені можливість виступити на цій конференції. Я представляю Інститут фізіології імені О. О. Богомольця, Відділ загальної та молекулярної патофізіології. Мій н ауковий керівник – Академік НАН України Олексій Олексійович Мойбенко. Тема моєї доповіді: Вплив ω-3 поліненасичених жирних кислот на структурні зміни коннексину-43 при стрептозотоцин-індукованому цукровому діабеті .
- За даними ВООЗ цукровий діабет (ЦД) нині – це епідемія неінфекційного походження. Серцево-судинні захворювання є головною причиною смертності при ЦД – 80 % (Тронько М. Д. Аналіз, пріоритети, шляхи виконання державної цільової програми «Цукровий діабет» на 2009-2013 роки // Здоров2я України,номер 18 (247) за сентябрь 2010 года, С. 42-43 ). Схоже, що структурна перебудова міокарду при патології серцево-судинної системи пов`язана з ремоделюванням внутрішньоклітинних щілинних контактів, яке сприяє розвитку ішемічних пошкоджень міокарду [ Ruiz-Meana1 M., Rodrıguez-Sinovas A., Cabestrero A., Boengler K., Heusch G., Garcia-Dorado D. // Cardiovascular Research. – 2008. – 77. – Р.325–333. ] та аритмій . Щілинні контакти складаються з коннексинів.
- В рамках спільного українсько-словацького проекту SRDA SK-UA-0022-09 у Інституті серця САН було виконано непряму імунофлуоресценцію на серії поперечних зрізів незафіксованої тканини грудної аорти і шлуночків серця, товщиною 10 мкм . Фіксацію проводили у 4% параформальдегіді тричі по 5 хв. Зрізи інкубували з первинними моноклональними мишачими анти-коннексин 43 антитілами (1:100, Chemicon Int., Inc., USA) 1,5 год (зрізи аорти – протягом ночі) за кімнатної температури, використовували вторинні FITC кон`юговані козячі анти-мишачі антитіла (1:100, Chemicon), інкубували 1,5 год у темряві. Первинні антитіла виступили в якості негативного контролю. Після відмивання у PBS , зрізи фіксували у середовищі для фіксації Vectashield mounting medium (Vector Laboratories, USA) і фотографували через флуоресцентний мікроскоп Axiostar fluorescent microscope (Carl Zeiss, Germany). Фотографії були оцифровані і кількісний аналіз зображень здійснювався за допомогою програмного забезпечення Soft Imaging System,GmBh, Germany. В серці оцінювали 16 (у аорті – 12) випадково обраних ділянок. На кожній обраній ділянці було отримано імунофлуоресцентне забарвлення коннексину 43, і використано для обрахунку площі сигналу коннексину 43, інтенсивність свічення якої була виражена напівкількісним методом.
- Нами виявлено, що отримання щурами ω-3 ПНЖК статистично значимо попереджувало зниження маси тіла і призвело до зниження рівня глюкози крові у тварин з ЦД .
- Як наведено на Діаграмі 1 розвиток ЦД (ІІ група) призводив до статистично значимого збільшення вмісту арахідонової кислоти та деякого зменшення вмісту α-ліноленової кислоти порівняно з контролем. Застосування препарату ω-3 ПНЖК в ІІІ групі дослідів змінює жирнокислотний склад гомогенату тканини міокарда за умов ЦД. Зокрема в серці поряд зі збільшенням вмісту α-ліноленової кислоти більш, ніж у два рази (на 157,2 %) відбувалось статистично значиме зменшення вмісту арахідонової кислоти. Таким чином, додавання до раціону харчування ω-3 ПНЖК призводить до модифікації жирнокислотного складу клітинних мембран серця, зокрема збільшенню вмісту ω-3 ПНЖК та зменшує вміст арахідонової кислоти, що може покращувати стан ССС. Більшістю дослідників зазначається, що жирні кислоти, які вбудовуються в мембрану внаслідок отримання тваринами ω-3 ПНЖК можуть змінювати низку внутрішньоклітинних та мембранних функцій, таких як потік іонів, транспорт електронів, активність мембранних ферментів, функції рецепторів та внутрішньоклітинних вторинних месенджерів. Так в роботі Holguin et al .(2005) показано, що збагачення раціону α-ліноленовою кислотою покращує автономну функцію серця і має антиаритмічний вплив [17]. Раніше Шиш А. М. та ін. було показано, що зниження вмісту арахідонової кислоти сприяє зменшенню кількості прозапальних цитокінів, тромбозу, набряку, вазоконстрикції коронарних судин, ішемічних та аритмогенних реакцій [2]. Також є відомості, що використання ω-3 ПНЖК може сприяти більш ефективному використанню кисню і утилізації енергії через активацію метаболічного резерву серця [26].
- На мікрознімку продемонстровано, що розвиток ЦД супроводжувався порушенням розподілу коннексину 43 в міокарді лівого шлуночка. Так, відмічалося розсіювання, латеральний перерозподіл, поява поодиноких імунореактивних частинок коннексину 43 у вставних дисках та на поверхні мембрани. Тоді як в нормі (контрольний мікрознімок) Сх 43 локалізується у вставних дисках. порушення цілісності КМЦ у тканині ЛШ. Дані підтверджуються статистично значимим підвищенням середньої інтенсивності імунофлуоресцентного сигналу коннексину 43 на 19,975% (20Х) . У тканині лівого шлуночка щурів, які на фоні ЦД отримували ω-3 ПНЖК спостерігали деяке зниження імунофлуоресцентного сигналу коннексину 43 на 6,72% (20Х). Також показана нормалізація просторового розташування, локалізація Сх 43 у вставних дисках, впорядкованість і відновлення цілісності КМЦ у лівому шлуночку щурів ІІІ групи.
- За результатами Western blot аналізу під впливом стрептозотоцину експресія коннексину 43 в серці статистично значимо зростає на 68,28%, порівняно з контрольною групою. Експресія коннексину 43 на фоні дієти знижувалась статистично значимо на 20,06% , порівняно з групою ЦД. Таким чином під впливом стрептозотоцину у міокарді тварин відбувається підсилення інтенсивності імунофлуоресцентного сигналу, порушення розподілу і гіперекспресія коннексину 43. Введення до раціону харчування ω-3 ПНЖК викликало нормалізацію імунореактивності та експресії коннексину 43 в міокарді ЛШ щурів з ЦД. Заморожену тканину лівого шлуночка розтирали у ступці до порошкоподібного стану і лізували у розчині SB20 (20% SDS, 10 ммоль/л EDTA, 0.5 ммоль/л ортованадат натрію, 0.1 моль/л TRIS, pH 6.8) за допомогою ультразвуку. Загальну концентрацію білку визначали за методом Bradford. Рівна кількість білку у кожному зразку була розділена за допомогою електрофорезу в поліамідному гелі в присутності 10% додецилсульфату натрію (SDS) і перенесена на мембрану з полівініліденфториду ( PVDF ). З метою блокування неспецифічних зв`язків отримані реплікати блокували 5% розчином сухого знежиреного молока з TRIS блокуючим буфером, TBS (20 ммоль/л Tris, 150 ммоль/л NaCl, pH 7.4-7.6) протягом години. Далі мембрану інкубували з первинними кролячими ? антитілами (анти-коннексин 43 C 6219, Sigma-Aldrich у розведенні ? 1:2000) проягом ночі при 4°C з наступною інкубацією протягом години з вторинними ? антитілами (мічений пероксидазою хріна ? анти-кролячий імуноглобулін, Amersham Biosciences, 1:2000). Зв`язані антитіла визначали за методом хемілюмінесцентної детекції ECL , оптичну щільність зв`язків аналізували за допомогою програмного забезпечення PCBAS 2.08e, використовуючи GADPH (анти- GADPH антитіла) в якості внутрішнього контролю.
- За результатами імуногістохімічного дослідження в групі ЦД визначено зменшення числа Сх 43-позитивних частинок всередині м ` язових частин та ендотелію аорти і не впорядкованість структурних елементів аорти в порівнянні з контрольною групою. Дані підтверджені результатами статистичного аналізу, що відображають зниження числа імунореактивних частинок в 1 мм2 ендотелію і середньої оболонки, зниження співвідношення площі ІФ реакції/площі виміряної тканини аорти при ЦД. Додавання до раціону ω-3 ПНЖК нормалізувало розподіл коннексину 43, сприяло більш впорядкованому розміщенню структур аорти, порівняно з групою ЦД. Представлені результати статистичного аналізу свідчать про нормалізацію числа імунореактивних частинок в 1 мм2 ендотелію і середньої оболонки, співвідношення площі ІФ реакції/площі виміряної тканини аорти у щурів ІІІ групи. Отже, нами показано, що стрептозотоцин-індукований ЦД змінював розподіл коннексину 43 і знижував інтенсивність імунофлуоресцентного сигналу в тканині аорти щурів, а отримання ω-3 ПНЖК викликало відновлення розподілу та імунореактивності коннексину 43 в аорті щурів з ЦД.