How to design primer and how to use some programs for primer design

1. PCR primer design
Methee Sriprapun, PhD
(Principle and how to design primers)
Sriprapun.m@gmail.com

2. Objective of primer usage
•เพื่อใช้สร้างสาย cDNA เพื่อนาไปใช้ในปฏิกิริยา PCR •เป็นจุดเริ่มต้นในการสังเคราะห์ DNA สายใหม่
•เป็นจุดเริ่มต้นในการทา DNA sequencing
http://seqcore.brcf.med.umich.edu/doc/educ/dnapr/sequencing.html
http://kem-en-tec-nordic.com/pcr-page/

3. Types of primer
•Oligo dT (16-20 T primer)  primes at the poly-A tail of mRNA
• Random hexamers: Total RNA template for cDNA
•Gene specific primer: usually uses reverse primer
http://www.thermoscientificbio.com/general-reagents-and- accessories/primers-for-cdna-synthesis/
http://www.bio.davidson.edu/genomics/method/cDNAproduction.html

4. General guidelines for primer design
•ขนาดของ primers ควรมีความยาว 18-30 bp
•เบส GC ใน primer แต่ละเส้นควรมีประมาณ 40-60% •Tm ของ primer แต่ละเส้นควรอยู่ในช่วง 55-66 C และ primers ทั้ง 2 เส้นควรมีอุณหภูมิต่างกันไม่เกิน 2 C •ปลาย 3’ ของ primer แต่ละเส้นควรมี G or C แต่ไม่ควรเกิน 2 ตัวในส่วน ที่เป็น 5 base สุดท้าย •หลักเลี่ยงการออกแบบที่มีเบสซ้ากันหลายๆ ตัว ( 3 or more) •หลีกเลี่ยงการเกิด mismatch ระหว่าง primer กับ template บริเวณ 3’end

5. General guidelines for primer design (II)
•หลีกเลี่ยง secondary structure ได้แก่
- Hairpin
- Self-complementary (primer จับกันเองเช่น F-F)
- Primer-dimer
3’
5’
DNA template
5’
3’
ปลาย 3’ ของ primer ต้องใส่

6. •ต้องตรวจสอบ primers ที่ออกแบบว่ามีความจาเพาะหรือไม่  blast กับ database
•เมื่อออกแบบแล้ว F primer: ใช้ได้เลย •แต่ R primer: จะต้องทา reverse complement ก่อนจึง blast หรือสั่งสังเคราะห์ primer •ยกเว้นบางโปรแกรมที่ reverse complement ให้เลยเช่น Primer-BLAST •ถ้า design for qPCR: PCR product ต้องไม่เกิน300 bp)
General guidelines for primer design (III)

7. Avoid secondary structure
•Hairpin loop
•Self-complementary
•Primer-dimer
https://bioweb.uwlax.edu/GenWeb/Molecular/seq_anal/primer_design/primer_design.htm
http://www.nature.com/nprot/journal
/v1/n3/fig_tab/nprot.2006.247_F2.html

8. Calculation of Tm and annealing temperature
•Tm เป็นอุณหภูมิที่ทาให้ dsDNA  ssDNA 50%
Tm= 2 x (no. of [A+T]) + 4 x (no. of [G+C])
Annealing temp. = Tm of primer - 5
http://www.gravitywaves.com/chemistry/CHEMXL153/NucleotidesCompandStruc.htm

9. Tm calculation quiz
Tm= 2 x (no. of [A+T]) + 4 x (no. of [G+C])
Annealing temp. = Tm of primer - 5
Sequence
Tm (C)
Annealing Temp. (C)
5’ GAT TAC TTG GGC AAG GCC GA 3’
62
57
5’ ATG GGC AAT AAT TTG GGA 3’
50
45
5’ ATT GGC AAG TTG AAG GCG GGG 3’
64
59
5’ TTG TTG AAG AGC CCC GGA C 3’
60
55

10. Reverse complement
•Reverse: change nt. sequence from (5’3’) to (3’5’)
•Complement with the reversed sequence •ทิศทางของสายเหมือนเดิม เปลี่ยนแค่ลาดับ sequence •กระทาที่ sequence ในแต่ละสายเท่านั้น (ทิศการอ่านคงเดิม)
5’CTCCAAGCTCCAAGCTCCAG 3’ Reverse: 5’GACCTCGAACCTCGAACCTC 3’ Complement: 5’CTGGAGCTTGGAGCTTGGAG 3’
ดังนั้นสาย reverse complement ที่ได้คือ :………………………………..
Courier New เป็น font ที่เหมาะในการพิมพ์ sequence ที่สุด

11. How to design primers
1. Manual design
- นา sequence มาเลือกตาแหน่งเอง
- นายีนที่สนใจทั้งหมดมา alignment เลือกตาแหน่งที่ conserve
( Universal primers)
- จากนั้นจึงนาเข้าโปรแกรมตรวจสอบลักษณะของ primers เช่น
ความยาว, %GC, Tm, specificity to DNA target, etc.
- จะเหมาะในงาน multiplex PCR หรือการออกแบบ probe ในงาน
บางอย่าง

12. Multiple sequence
alignment for
primers and probe
design

13. Universal primers for PCR assay

14. How to design primers (II)
1. Program design
- ใช้โปรแกรมช่วยออกแบบ primers ต่างๆ
- สะดวก รวดเร็ว ประหยัดเวลา สามารถตั้งค่าต่างๆ ได้มาก
- ไม่เหมาะในการออกแบบ primers ที่ทา multiplex PCR
- ปัจจุบันมี program ช่วยออกแบบ probe for qPCR
- ไม่สามารถออกแบบ primers ที่มีการ modified ที่ปลาย 5’ ได้

15. Program for primer design
(Abd-Elsalam KA, Afr J Biotechnol 2003)

16. Primer design with Primer-BLAST
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
•Developed by NCBI
•Primer3 to design PCR primers + BLAST and global alignment algorithm to screen primers

17. Primer-BLAST
•Primer design & BLAST primers with sequences in database •เมื่อมี primers อยู่แล้วแต่ไม่ทราบขนาด PCR product  ตรวจสอบได้ •เมื่อมี primers อยู่แล้ว  BLAST ดูการจับของ primers กับ template ได้ •ข้อเสีย: เนื่องจากโปรแกรมต้องทาการ Blast หลังออกแบบ primers  ใช้เวลานาน

19. How to use primer-BLAST
•เลือกยีนที่ต้องการออกแบบ primer ควรเลือกที่เป็น mRNA เพื่อ หลีกเลี่ยงการ design ตรงส่วน exon (ดู organism ด้วย) หรืออาจเลือก ยีนของ pathogens ที่ต้องการออกแบบ •นา sequence ที่สนใจ (อาจเป็น FASTA, sequence อย่างเดียว หรือ Accession No.) ใส่โปรแกรม
•ตั้งค่า parameter ต่างๆ แล้ว กด Get primers •พิจารณา primers โดยดูจากค่า Tm, self-complementary, GC content, etc. •Sequence ของ primers ทั้ง 2 เส้น สามารถใช้ได้เลยไม่ต้อง reverse complement

20. ตัวอย่าง ต้องการออกแบบ primer เพื่อตรวจหายีน -actin ของคน โดย ให้มี Tm = 60C PCR product 100-300 bp
เลือกยีน -actin (human) จาก NCBI
 นา sequence หรือ accession No. ใส่ตรงช่อง PCR template
ใส่หรือไม่ก็ได้

21.  ตั้งค่า parameter ต่างๆ ได้แก่ ขนาด PCR product และ Tm ของ primers
เปลี่ยนเป็น nr
จะใส่หรือไม่ก็ได้
 จากนั้นกด Get Primers

22. Result
จานวน primers ที่ design ออกมาได้ทั้งหมด 5 คู่
ผลที่ได้
1.ข้อมูล primers และ parameters ต่างๆ
2.ขนาด PCR product
3.ผล blast ว่า primers จับจาเพาะกับ สิ่งที่ต้องการหรือไม่

23. How to check secondary structure
OligoCalc
http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html

24.  Copy sequence primer แต่ละเส้นวางตรงนี้
เลือกให้เป็น ssDNA
กด calculate

25. ตัวอย่างลองเอาเส้น F และ R primers จากการออกแบบมาทดสอบดู
Result
ได้ reverse complement sequence
ได้ค่า
parameters
ต่างๆ

26. Click เพื่อดู
secondary structure
Result

27. Primer design with Primer3
•Online program: ปัจจุบันมีทั้ง Primer3 และ Primer3Plus •Primer3Plus มีการพัฒนาในเรื่องประสิทธิภาพของการ ทางาน (แต่การใช้โปรแกรมทั้ง 2 ไม่ต่างกัน)

28. http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/
ใส่ sequence ที่ต้องการออกแบบ primer
กดเพื่อให้ โปรแกรม design
ตั้งค่า parameters ต่างๆ
(ปกติตั้งแค่ตรงนี้พอ ที่เหลือใช้ค่า default)

29. ตัวอย่าง ต้องการออกแบบ primer เพื่อตรวจหายีน -actin ของคน โดย ให้มี Tm = 60C PCR product 100-300 bp
เลือกยีน -actin (human) จาก NCBI
 นา sequence ใส่ในช่องว่างที่มีลูกศร หรือ upload FASTA file of interested sequence

30.  ตั้งค่า parameter ต่างๆ ได้แก่ ขนาด PCR product และ Tm ของ primers
 จากนั้นกด Pick Primers

31. โปรแกรมบอกรายละเอียดของ primers เช่น Tm, %GC
ข้อมูล secondary structure, product size

32. ให้ข้อมูลตาแหน่ง ของ primers บน sequence ที่เรานามาออกแบบ
ข้อมูล primers อื่นๆ ประกอบการพิจารณา
ของผู้ใช้งาน

33. ถ้าต้องการ primers ชุดไหน ก็กด Send to Primer3 Manager ได้เลย
ต้องการ Blast กับ GenBank (แต่เป็นการ blast ทีละเส้น)

34. ถ้าต้องการ check การจับกันของคู่ primers ว่าจาเพาะกับยีนที่ต้องการหรือไม่ สามารถ copy sequences ไปที่ Primer-BLAST ได้ (แต่อาจใช้เวลานาน)
ใส่ตรงนี้
เปลี่ยนเป็น nr
จะใส่หรือไม่ก็ได้ (organism)
จากนั้นกด Get Primers

35. ถ้าต้องการ check secondary structure เพิ่มเติม  Program OligoCalc
Primers ที่ได้สามารถ Order ได้เลยไม่ต้อง reverse complement
ข้อดี: รวดเร็ว ประหยัดเวลา
ข้อเสีย: Blast primer ได้ทีละเส้นเท่านั้น ถ้าจะดูการจับของ primers ต้องใช้ อีกโปรแกรมหนึ่งช่วย

36. Tips for consideration
•Program for primer design  tool for prediction of
primers •ผลการออกแบบ primers อาจใช้ไม่ได้ 100% ในการทางานจริง •Primers คู่แรกมักเป็น primers ที่ดีที่สุดที่โปรแกรมเลือกให้ •Program for primer design เป็นเหมือนเข็มทิศ และ tool ที่ อานวยความสะดวก และ ลดระยะเวลาการทางานเท่านั้น •ต้องมีการ Optimization PCR ในการทางานจริงเสมอ !

37. Primer design at a glance
เลือกสิ่งมีชีวิต และ/หรือ ยีนที่สนใจจากฐานข้อมูลต่างๆ เช่น GenBank, EMBL, DDBJ, etc.
Download sequence ในรูป FASTA หรือจดจา Accession No. ของยีนนั้น
นา sequence ไปออกแบบกับโปรแกรม Primer design ที่ได้เลือกไว้หรือทาการออกแบบ
โดยวิธี manual (ถ้าเป็น universal primer  multiple sequence alignment เลือก conserve sequence)
เลือก primers ตาม condition ที่ผู้ใช้ต้องการ
พิจารณา primers ว่าตรงตาม Guidelines of primer design หรือไม่
ตรวจความถูกต้องของ sequence primer จากนั้นสั่งสังเคราะห์ primers
นามาใช้จริงกับงาน PCR หรือ RT-PCR รวมถึง try condition กับ น้ายาที่ใช้
โดย: ทนพ.ดร. เมธี ศรีประพันธ์