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DNAマイクロアレイの解析と多重検定補正
- 4. マイクロアレイとは マイクロアレイ = 基盤上に何かを固定化させたもの Micro：1/1000レベルに分割して Array：並べたもの DNAマイクロアレイ = DNAを基盤上に固定化 細胞マイクロアレイ = 細胞を基盤上に固定化 タンパク質マイクロアレイ 抗体アレイ 組織マイクロアレイ 化合物マイクロアレイ …
- 7. データ取得 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE30668 対照群 (n=4) カロリー制限群 (n=4) AL1.CEL AL2.CEL AL3.CEL AL4.CEL CR1.CEL CR2.CEL CR3.CEL CR4.CEL
- 8. 正規化、対数変換 1色法（Affymetrix型）はRMA,MAS5がよく使われる 2色法（Oxford型）はLOWESSがよく使われる # ライブラリロード library(“affy”) # CELファイルを読み込む Data <- ReadAffy() # RMA正規化+対数変換 est <- rma(Data) express <- exprs(est) # コントロールプローブ削除 express <- express[1:31042,] # データ保存 write.table(express, “rma.txt”) 31042×8 行列 1.2 1.4 1.4 1.3 1.5 0.4 0.6 0.9 1.5 1.6 0.7 0.4 4.3 4.2 4.1 4.0 2.4 2.5 2.9 2.2 1.9 1.3 1.5 2.31399167_a_at 1367453_at 1367452_at AL1 .CEL AL2 .CEL AL3 .CEL AL4 .CEL CR1 .CEL CR2 .CEL CR3 .CEL CR4 .CEL
- 9. 検定 たくさんの検定手法が提案されている を参考 # t検定 p <- c() for(i in 1:31042){ p[i] <- t.test( express[i, 1:4], express[i, 5:8] )$p.value } # データ保存 names(p) <- rownames(express) write.table(p, “p.txt”) 0.1405 0.0013 0.0355 p値 1.2 1.4 1.4 1.3 1.5 0.4 0.6 0.9 1.5 1.6 0.7 0.4 4.3 4.2 4.1 4.0 2.4 2.5 2.9 2.2 1.9 1.3 1.5 2.31399167_a_at 1367453_at 1367452_at AL1 .CEL AL2 .CEL AL3 .CEL AL4 .CEL CR1 .CEL CR2 .CEL CR3 .CEL CR4 .CEL 1399167_a_at 1367453_at 1367452_at
- 10. FDR制御 FDR、q値（またはQ値）って何なのかは次のページ以降で説明 q値 # 別途パッケージロード library(“fdrtool”) # FDR制御 fdr1 <- p.adjust(p, “BH”) fdr2 <- fdrtool(p, statistic=“pvalue”)$qvql fdr3 <- fdrtool(p, statistic=“pvalue”)$lfdr # データ保存 names(fdr1) <- rownames(express) names(fdr2) <- rownames(express) names(fdr3) <- rownames(express) write.table(fdr1, “BH.txt”) write.table(fdr2, “Q.txt”) write.table(fdr3, “LFDR.txt”) 0.1405 0.0013 0.0355 p値1399167_a_at 1367453_at 1367452_at 0.1555 0.0257 0.05921399167_a_at 1367453_at 1367452_at
- 11. 多重検定補正
- 12. 提案された色々な多重検定法 • FWER: Family-wise Error Rate – Bonferroni、Tukey、Dunnet … • FDR: False Discovery Rate – BH、ABH、BY、Q-value、LocalFDR … • その他：GFWER、TPPFP、EFP、ETP
- 13. BH法の原著論文（みんなが引用するからすごいことに） 最近の論文は多重性を考慮していないと査読 で何かと文句言われる Gabriele Zoppoli, et. Al., PNAS, 2012 Barry S. Taylor, et. al., Cancer Cell, 2010 Simon Anders, et. Al., Genome Biology, 2010
- 14. 多重検定って？ 検定数があまりにも多いと、通常の有意水準 0.05はほぼ100%一度は間違う事に相当する 有意水準を0.05と設定したとする n=1の時 0.05 n=2の時 1 - (1-0.05)2 = 0.0975 n=3の時 1 - (1-0.05)3 = 0.142625 … n=kの時 1 – (1-0.05)k 仮説検定数 有意水準 複数回検定をする場合、間違った結果を含む確率が増加する
- 16. FWER制御法：Bonferroni法 マイクロアレイ等の超多重検定の場合、FWERでは基準が厳しすぎ → 一つの遺伝子も有意に判定できない Bonferroniの不等式 𝑃 𝐸𝑖 𝑘 𝑖=1 ≤ 𝑃(𝐸𝑖) 𝑘 𝑖=1 有意水準をα=0.05にしたい場合、検定数で割る α/N 𝑃(𝐸𝑖): 事象Eiが起こる確率 例：k=3 𝑃 𝐸1 ∪ 𝐸2 ∪ 𝐸3 ≤ 𝑃 𝐸1 + 𝑃 𝐸2 + 𝑃(𝐸3) FWER制御：一度でも間違う確率を制御する
- 18. p値の分布は一様分布とする BH法 Yes No p値の分布は帰無仮説と対立仮説の 混合分布とする（混合比 π0 : 1 - π0) 自然スプライン回帰でπ0を推定 + BH法のq値にπ0をかける ベイズの定理における 事後分布として解釈 Q-value法 LocalFDR法 𝑞𝑖 = 𝑝𝑖 × 𝑁 𝑖 𝑄𝑖 = 𝜋0 × 𝑝𝑖 × 𝑁 𝑖 𝑙𝑓𝑑𝑟 = 𝑓0 𝑝 × 𝜋0 𝑓(𝑝) 𝜋(𝜃|𝐷) = 𝑓(𝐷|𝜃) × 𝜋 (𝜃) 𝑓(𝐷)
- 19. FDR制御法：BH法 ①p値を昇順に並べ替え ②p値をq値に変換 i： 昇順に並べた時の上からの順番 N： 全遺伝子数 ③閾値以下のq値の遺伝子を発現変動したとする 0.005gene5 0.06gene4 0.1gene3 0.001gene2 0.21gene1 p-value 0.001（gene2） 0.005（gene5） 0.06（gene4） 0.1（gene3） 0.21（gene1） ○gene5 ×gene4 ×gene3 ○gene2 ×gene1 発現変動 0.001*(5/1) = 0.005 0.005*(5/2) = 0.00125 0.06*(5/3) = 0.1 0.1*(5/4) = 0.125 0.21*(5/5) = 0.21 ① ② ③q値p値 < 0.05 < 0.05 > 0.05 > 0.05 > 0.05 閾値 = P = E[FP] 𝑞𝑖 = 𝑝𝑖 × 𝑁 𝑖
- 20. p値の一様分布性の破綻 BH法が想定しているp値の分布 実際のデータでのp値の分布 （0側に偏る場合が多い） # 一様分布シミュレーション for(i in 1:31042){ x <- rnorm(4) y <- rnorm(4) pp[i] <- t.test(x, y)$p.value } # プロット hist(pp) # 実際のデータのプロット hist(p)
- 21. FDR制御法： Q-value法 帰無仮説（差が無い） 対立仮説（差が有る） 0側に寄る 一様分布する 0側に寄り気味な 一様分布ができる 平均値の差 頻度 0 0 0 1 1 1 頻度 頻度 頻度 混合分布 0 𝑄𝑖 = 𝝅 𝟎 × 𝑝𝑖 × 𝑁 𝑖 帰無仮説：対立仮説 = 𝜋0 ∶ 1 − 𝜋0
- 22. FDR制御法： LocalFDR法 𝑃 𝐻0|𝑝 = 𝑙𝑓𝑑𝑟 = 𝑓0 𝑝 × 𝜋0 𝑓(𝑝) 帰無仮説（差が無い） 対立仮説（差が有る） 平均値の差 頻度 0 𝑃 𝐻1| 𝑝 = 1 − 𝑓0 𝑝 × 𝜋0 𝑓(𝑝) ベイズの定理 𝑃 𝐻|𝐷 = 𝑃(𝐷|𝐻) × 𝑃(𝐻) 𝑃(𝐷) D: データ H: 仮説