分子生物学学习笔记，根据北京大学医学部授课讲义和学习笔记，并整合网上一些学习资料，整理而成。可作为研究生入学考试分子生物学科目参考资料。更多精彩教程，请访问缤果网(http://www.bingomed.com)

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分子生物学笔记
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缤果学院 (http://www.bin.co/edu/)
2008-01-01

2. 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bin.co/)
目录
第一部分 多聚酶链反应 ....................................................................................................................................... 3
PART A. PCR 总论 ................................................................................................................................................... 3
一、原理 ................................................................................................................................................................... 3
☆二、PCR 反应的主要成份及作用 ....................................................................................................................... 3
三、DNA 重组技术.................................................................................................................................................. 4
PART B. PCR 各论 ................................................................................................................................................... 7
一、检测基因的表达 ............................................................................................................................................... 7
二、对差异表达基因的筛选 ................................................................................................................................... 8
三、PCR 在突变中的应用 ..................................................................................................................................... 10
四、基因拼接 ..........................................................................................................................................................11
五、免疫 PCR..........................................................................................................................................................11
六、竞争性 RT-PCR(Competition RT-PCR) .......................................................................................................... 12
七、RNAi(RNA 干扰实验).................................................................................................................................... 12
八、基因表达调控(适合未知基因组) ................................................................................................................... 12
九、如何分析转录因子与其顺式作用序列的作用？.......................................................................................... 13
第二部分 DNA、cDNA 克隆及哺乳动物细胞基因表达分析.......................................................................... 14
PART A. DNA 克隆 ................................................................................................................................................ 14
一、概论 ................................................................................................................................................................. 14
二、重组 DNA 技术(克隆) .................................................................................................................................... 14
PART B. 基因克隆(Gene Cloning) ........................................................................................................................ 17
一、重组 DNA 文库............................................................................................................................................... 17
第三部分 基因克隆和功能分析、基因表达调控.............................................................................................. 20
PART A. 基因克隆和功能分析 ............................................................................................................................. 20
一、从基因到蛋白 ................................................................................................................................................. 20
二、从蛋白到基因 ................................................................................................................................................. 22
PART B. 基因的功能分析 ..................................................................................................................................... 23
一、基因功能分析 ................................................................................................................................................. 23
二、RNA 干扰 ........................................................................................................................................................ 25
PART C. 基因表达的调控 ..................................................................................................................................... 27
一、基因转录的调控 ............................................................................................................................................. 27
附：DNA 甲基化材料............................................................................................................................................ 31
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第一部分 多聚酶链反应
PART A. PCR 总论
一、原理
(1)热变性(94℃,1min)
(2)退火(G+C 含量<50%选 55℃，>50%选 60℃,1min)
(3)延伸(72℃,产物长度<500nt 时，选 1min，>500nt 时选 3min)
☆二、PCR 反应的主要成份及作用
1. DNA Pol：主要是耐热的 DNA Pol
分两类，一类具有校正功能(3’->5’外切酶活性)，如 vent, pfu, pwo；另一类不具有校正功能，如 Taq
DNA Pol。
2. 引物
(1)长度 15~30bp 为宜，过短降低特异性，过长会增加成本；
(2)碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶堆积现象，G+C 含量控制在 45~55%左右；
(3)引物内部避免形成二级结构，两个(上游和下游)引物之间尤其是 3’末端不应该有互补链；
(4)引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性；
RT-PCR 时应注意，提取 RNA 都包含少量 DNA，由于 DNA 由包括内含子和外显子，而 mRNA 是外
显子拼接组成，所以如果选择引物在一个外显子内，同时也有可能将 DNA 扩增；所以设计引物时，应该
位于不同外显子之间。
(5)原则上引物 3’末端与模板序列应严格配对(应避开密码子第 3 位)，其末位碱基很大程度上影响着扩增
效率；而引物 5’末端无严格限制，常作为限制性内切酶或其它标记位点(酶标位点 5’末端适当加些保护
碱基)，也可加上 ATG 起始密码，或人为错配碱基造成突变。
退火温度取决于引物 Tm 值，4(G+C)+2(A+T)(大致估计)，以低于 Tm 值 2~4℃，如果扩增不出，可每
次降低 2℃。
3. PCR 反应缓冲液
组成：50 mM KCl；10 mM Tris Cl (pH8.4)；1.5 mM MgCl2。
Mg2+是 Taq Pol 活性所必须的金属离子。
4. 底物 dNTP 浓度
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dNTP 浓度应该在 20~200 uM，浓度过高可加快反应速度，同时增强了错配率和实验成本；反之，低
浓度可导致反应速度降低，但可提高实验的精确性。
以 50ul 体积为例，10*buffer 5 ul，dNTP(每种 10mM)1 ul，primer 1,2(10uM)各 1ul，Taq DNA pol(2~4ul/L) 1
ul，ddH2O 补至 50 ul。
5. 如何增加 PCR 特异性
(1)家族 DNA，应选择非同源序列；
(2)设 Tm=56℃，可从 Tm 开始依次增加退火温度，看能否增加特异性；
(3)Touch down PCR：首先从高温度退火(设 Tm=60℃)
94℃(变性) 94℃ 94℃ 注：两步法，退炎
* 5 Cycle 70℃ * 5 C
ycle 60℃ * 5 C
ycle 温度高，特异
72(退火、延伸) 72℃ 72℃ 性高。
(4)佐剂(甘油 3% or DMSO，这些试剂使 Tm 值增加)
(5) 引物设计[a) 加长引物长度，增强特异性；b)G+C 含量高，Tm 值高，两步法]
三、DNA 重组技术
1、概念
用酶学方法，将不同来源的 DNA 分子与载体 DNA 结合成为复制子，导入宿主细胞，筛选出含有目的基因
的转化子细胞，再进行扩增，从中提取获得大量同一种 DNA 分子。
2、DNA 克隆过程
“分切接转筛”
，筛选出的基因再进行 PCR 扩增。
☆3、常见工具酶
(1) 限制性核酸内切酶
识别 DNA 的特异序列，并在识别位点或其周围切割 DNA 双链结构的一类内切酶。
应用：将大片段的 DNA 切割成小片段，将环状 DNA 切割成线状，便于克隆；利用限制性内切酶图谱鉴定
DNA。
(2) 外切酶
①核酸酶 S1
特征：高度特异性的单链内切酶，可降解单链 DNA 或 RNA，在尿素，SDS 和甲酰胺中稳定。
应用：a) 分析抗 S1 核酸酶降解的 RNA：DNA 杂合体以定位 RNA 转录物的 5’和 3’末端；b) 通过
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消化成熟 RNA 分子与 32P 标记的基因组 DNA 杂交形成的杂合体，确定内含子的位置；c) 消化在以反转
录酶合成 cDNA 时形成的发卡结构；d) 去掉 DNA 片段的单链突出末端，产生用于连接的平端。
②脱氧核糖核酸酶 I(DNaseI)
特征：DNase I 是需二价阳离子的外切酶，降解双链 DNA 产生带 3’羟基的寡核苷酸。在 Mg2+存在
下，在双链 DNA 上产生缺口，在 Mn2+存在下，断裂双链 DNA。
应用： 用切口平移法进行放射性探针标记； 去除样品中的 DNA； 可用 DNase I 分析蛋白(DNA
a) b) c)
酶足迹法)；d) 在 Mn2+存在时随机裂解 DNA 双链，用于随机克隆。
(3) DNA 聚合酶
①DNA 聚合酶 I
特征：活性包括 5’->3’ DNA 聚合酶活性、3’->5’外切酶活性、5’->3’外切酶活性。其大片段
Klenow 片段具有 5’->3’ DNA 聚合酶活性、3’->5’外切酶活性。
应用：标记 DNA 的 3’末端；修饰突出的 3’或 5’末端以产生平端；随机寡核苷酸引物介导的 DNA
标记；克隆 cDNA 时合成第二链；双脱氧法 DNA 测序(Sanger 法)。
②Taq DNA 聚合酶
特征：来源于水生栖热菌 YT1 株；5’->3’ DNA 聚合酶活性，而高温；具有类似末端转移酶的活性；
在 Mn2+存在时具有反转录酶活性。
应用：目前 PCR 中应用最广泛的耐热 DNA 聚合酶。
③末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)
特征：在二价阳离子存在下，催化 DNA3-OH’末端加入脱氧核苷酸，用于 DNA 的克隆化和 DNA 探
针标记。
应用：给载体或 cDNA 加上互补的同聚尾；用于标记 DNA 片段的 3’末端。
(4) 连接酶
①T4 DNA 连接酶
来源于 T4 噬菌体感染的大肠杆菌，此酶是唯一在正常条件下，有效连接平端 DNA 的连接酶。常用于
连接粘性或平性末端。
(5)逆转录酶
来源：禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)；莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)。
特征：具有
a) RNA 依赖的 DNA 聚合酶活性；
b) DNA 依赖的 DNA 聚合酶活性(不具 3’->5’外切酶活性)；具有 RNaseH 活性，即从 5’或 3’端连
续降解 RNA 与 DNA 杂链内的 RNA 链部分。
应用：
a) 将真核基因的 mRNA 转录成 cDNA 文库；
b) 对具有 5’突出端 DNA 片段的 3’端进行填补和标记；
c) 代替 Klenow 酶用于 DNA 序列测定。
(6)T4 多聚核苷酸激酶
催化 ATP 的 r 位磷酸转移到 DNA 或 RNA 的 5’端羟基(高活性)，可应用于给单双链核酸分子 5’末
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端进行标记。
4. 目的基因的获取方法
(1)PCR 方法；(2)筛选 cDNA 文库；(3)筛选基因组文库；(4)化学合成法。
5. 载体
常见载体包括：质粒、噬菌体、病毒。
质粒作为载体具有下述特征：
(1)分子相对较小，3~10 kb 左右；
(2)具有松弛型复制子；
(3)在复制子以外适当的位置，存在几个单一内切酶位点，便于外源 DNA 片段的插入；
(4)具有抗药性和/或插入失活的筛选标记。
6. 将 PCR 产物克隆至载体的方法
Taq DNA pol 具有末端转移酶活性，粘性末端克隆效率比平性末端高。
(1)T/A 载体 5’ T 3’
3’ 5’T
5’ A 3’
3’ A 5’
①PCR 产物如何带 A？
a) 高保真的酶(3’->5’外切酶活性)
使新合成的链不带 A，即没有不依赖模板的核苷酸转移酶活性。
将 PCR 产物 + 10*buffer + Taq + dATP，72℃，30min。
b) 从胶回收，若 PCR 放置时间，A 易被水解掉，与上述方法相同。
②若 PCR 产物含有而又不需要 A
a) pfu 酶(高保真酶)与 PCR 产物保温；
b) T4DNA Pol 与 PCR 产物保温。
③T/A 载体制备
a) 限制性内切酶(平端)切割，然后加 T
DNA + 10*buffer + dTTP + Taq
b) 利用工程的寡聚核苷酸(人为设计)
含有 2 个限制性内切酶位点，Xcm I 切割两端带“T”。
T/A 载体的应用：连接 T/A 载体，用于测序；未知 PCR 产物 DNA 序列。
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(2)利用引物上限制性内切酶酶切位点
①限制性内切酶片段放在引物的 5’末端；
②识别序列两端必须有碱基保护，才能被限制性内切酶切割。
5’ ------AGCCGGATG----------3’
Msp I 识别位点
如果引物设计成 5’---CCGGATG---3’，Msp I 无法切割，可首先连接到 T/A 载体，再进行切割。
PART B. PCR 各论
(1)检测表达情况
(2)检测表达谱(在各个组织细胞表达情况，为寻找功能奠定基础)
新 gene
如管家基因，组织特异性表达，如在肝组织表达，说明与肝脏功能有关
新 Pr
(3)细胞内定位(如在线粒体内，可能与生物氧化有关，在细胞膜、质，可能
与信号有关，在核内可能与基因表达有关)
(4)寻找与它相互作用的蛋白质(免疫共沉淀、双杂交法)
如该蛋白与 Ras 相互作用，它可能与细胞增殖有关。
高表达该基因 封闭该基因。
一、检测基因的表达
Northern blot (固相杂交)
RT-PCR (√) (半定量，有时 RNA 表达差异体现不出)
Real-time PCR 实时 PCR (定量，加了荧光染料，对原始 RNA 进行定量)
核酸酶保护实验 (液相杂交，敏感性>Northern blot)
Virtual Nothern bl t
o SAGE 方法
基因表达具有时空特异性，故购买 cDNA 文库必须指明组织、阶段。
RT-PCR 过程(略)。
1. 基因表达检测
(1) PCR 指数增长期、平台期
进行基因表达比较时将 PCR 控制在指数增长期。
(2)进行逆转录时，两个样品逆转录效率不同，所以 RT-PCR 不能准确定量，只能称半定量 PCR。
2. 扩增读码框架
--------ATG----------------UAA--------
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8. 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bin.co/)
(1)为防止引物自身二级结构的形成，可利用好密码子的简并性(在 5’末端人工突变)
(2)引物设计不可太靠上游，因为 mRNA 常局部形成发夹结构。
(3)cDNA 合成时可用特异引物，而不用 poly T；
5’ AAAA 3’ mRNA
(下游)特异引物
(上游)引物
(4)随机引物(一般不主张)
反转录酶、Taq 酶缓冲液不一样，有些公司寻找出能适合该两种酶的缓冲液 —— 一步法。
二、对差异表达基因的筛选
1. 基因芯片
(假阳性太多)。怀疑基因改变，应用 Nothern blot 或其它技术验证。
2. DD 法(差异显示，different-display)：扩增出大小不同的 DNA 片段
AAAA
TTTT (合成的 cDNA 第一链下游多合成一段下游引物结合位点)
上游随机引物(要求退火温度偏低，因为随机引物较小，与模板结合能力较差)
cDNA 文库 5’ TTTT 3’
(测序胶，能分辩一个 bp 有差异) Normal Tumor
可根据条带的宽窄、有无来
检测基因表达情况。但有可能条
带宽度相同(核苷酸数目相同)但
碱基序列不一致。
看到有表达差异的可从胶中
回收、扩增、克隆、测序。
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3. 抑制性 PCR 法(suppression PCR)
带有相同接头和不同接头的 DNA 都能扩增。但带有相同接头不能指数扩增，而有不同接头可以指数
扩增。 接头(Adapter or Linker)
5’ 3’
接头引物
带有相同接头的 DNA 扩增后，由于 5’末端和 3’末端的接头形成配对，阻碍下一轮的扩增引物结合。
大部分形成茎环结构；只有小部分进入下一轮扩增。
4. 5’-末端快速扩增(5’-RACE)/ 3’-末端快速扩增(3’-RACE)
(1)RACE(cDNA 末端快速扩增， Rapid Ampliphication of cDNA Ends)是一种获得转录本 5'或 3'未知序列的方
法。不象普通 RT-PCR 那样使用两个序列特异性的引物，RACE 使用一个序列特异性的引物和或者 mRNA
的 poly(A)尾（3' RACE）或者加到 cDNA 末端的多聚同聚体（5' RACE） （图 11）
。
第一链引物(人工合成引物，modified oligo dT)，同 mRNA 退火
将 mRNA 转录成 cDNA
使用 RNase 混合物降解 RNA；纯化 cDNA
使用 dCTP 和 TdT 对纯化的 cDNA 加尾
5’ GG-GG (人工合成上游引物)
图 5' RACE 步骤概要
(注：在某些金属离子存在时，如没有帽子结构，末端转移酶活性降低；M-MuLV 具有不依赖于模板
的末端转移酶活性。如果合成的核苷酸序列形成局部配对，提前终止，由于没有帽子结构，无法发挥末端
转移酶活性；通过提高温度，去除局部互补)
5' RACE 比 RT-PCR 更具有挑战性，特异性也较低，因为只有一个引物是基因特异性的。5' RACE 的
产物可能是单一产物、多个产物，甚至是不能分辨的连续条带。结果的质量取决于用来合成第一链和扩增
的 GSP 的特异性、扩增所使用锚定引物的特异性、目的 mRNA 的复杂度和丰度及产物的长度。
(2)巢式 PCR(Nested PCR)
使用巢式引物扩增（最多可以三轮巢式扩增） ，并在连续几轮扩增中使用长度选择性的扩增产物作为
模板可以增加有限量靶序列(如稀有 mRNA)的灵敏度，并提高了 5' RACE 的特异性。增加逆转录保温温度
和 PCR 退火温度，并降低扩增反应中的镁离子浓度可以促进特异性。
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10. 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bin.co/)
第一轮引物
第二轮引物
(3)同一基因可有不同的剪切产物
外显子 1 2 3
转录产物 mRNA 可为：E1E2、E1E3、E2E3、E1E2E3。
与 Gene2 序列互补，作为 Gene2 扩增的上游引物。
(注：Chimera[kai’mi9r9] 希腊神话中狮头、羊尾、蛇身怪物。)
三、PCR 在突变中的应用
引物 3’末端严格互补，5’末端形成突变。
1. 点突变、插入突变、缺失突变(上左)
2. Gene1 突变并取代 Gene2 部分序列(上右)
3. 重叠表达导致突变(下左) 变性
退火 延伸
没有突变的，从细菌 突变的，体外合成的
提取的，往往甲基化 不带甲基化
DPn I 甲基化敏感限制性内切酶
可切割未突变母链，突变链不能切割，转录细菌
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4. 环状 DNA 突变(右上)
PCR 突变时，对 Tap 酶的要求：
(1)高保真(pfu)；
(2)突变位点两侧核苷酸序列往往是 18~20nt；
(3)突变的 nt↑数目会影响突变效率↓。
PCR 突变应用：
(1)验证转录因子与其结合位点是否为特异的；
(2)分析 Pr 功能，常把编码序列突变，检测其功能区域；
(3)常应用突变构建实验中的工具载体。
Rb(抑癌基因)， 假设 98 位为 Ser，
其-OH 发生-P 化时 Rb 失活，
cDNA 造成突变， 使其 98 位为非-OH AA，
不能-P 化而活性持续存在，将其转染入细胞可抑制细胞增殖；这种重组子称为 dominant negatively。
Q：如何从多个方面证明某 Gene 表达↑，对肿瘤具有保进作用？
A：(1)封闭 gene 表达，肿瘤生长↓：a)反义核酸；b)Dominant negatively；(2)(在不表达或低表达的细胞中)
过量表达，细胞增殖↑。
四、基因拼接
1. 基因拼接(下左图)
(1)不可发生读码框架移位；
(2)在两个 Gene 间设计铰链区，防止其高级结构相互影响。
在下游引物 3’末端加入编码铰链区的 cDNA。
五、免疫 PCR
沉淀 DNA，与染色体 DNA 紧密结合的是组 Pr。
Cancer 可能是由于癌基因量↑，而不是表达量↑；为了避免 RNA 干扰，检测 DNA 时可用免疫 PCR 法。
[注意：(1)高保真，特异性；(2)在 5’末端做文章。]
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六、竞争性 RT-PCR(Competition RT-PCR)
mRNA 扩增片段引物序列 DNA
反转录 AAA 设计一段与扩增片段无关的 DNA，长度应与扩增片
TTT 片段不同，但不能差太多
500bp 300bp
PCR
稀释
扩增片段 DNA 1 1:50 1: 00 1:200
1
加入共同的引物，PCR
竞争片段 (mini PCR)
扩增片段
七、RNAi(RNA 干扰实验)
RNSC
mRNA
要选择好耙位点，避免 mRNA 序列形成二级结构。
T1 U6 pr motor P
o CR
T1
(筛选 RNAi 有效片段) PCR
转染到宿主细胞
八、基因表达调控(适合未知基因组)
克隆调节序列
5’调节序列 E1 E2 E3 E4
mRNA
已知 cDNA 序列
Genome
1 2 3 产生平端的限制性内切酶(一般 4~5 种酶)
构建文库
分别加接头
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九、如何分析转录因子与其顺式作用序列的作用？
染色质免疫共沉淀(Chromosome Immune Pull-down, ChIP)
1. 甲醛：蛋白质和 DNA 交联；
2. 物理方法打断 DNA(超声法)；
3. 加入抗转录因子的抗体；
4. 亲和沉析，沉淀转录因子和顺式作用元件；
5. 去掉转录因子
注意：(1)Real-Time PCR；(2)做好阳性对照(结合位点，上游、下游为阳性对照)；(3)阴性对照(提取 DNA，
用引物扩增)
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第二部分 DNA、cDNA 克隆及哺乳动物细胞基因表达分析
PART A. DNA 克隆
一、概论
1. 基因、染色体及基因组(略)
2. 质粒(plasmid)：是存在于细菌染色体外的小型环状双链 DNA 分子，1 kb~200 kb，本身含有复制功能的
遗传结构，能独立进行复制。
优点： (1)利用宿主的酶可以快速复制； (2)较易从细菌或酵母菌中分离；(3)赋予宿主菌某些遗传性状(如
r r
抗氨苄青霉素 amp 、抗四环素 ter )。
MCR-multiple cloning region(多克隆位点)。
pCI-neo：Mammalian Expression Vector。
pBR322、pUC19 等质粒载体。
常用作克隆载体的还有噬菌体：lambda 噬菌体和 M13 噬菌体。
带有单链噬菌体复制起始点的质粒(M13 f1)，又称噬菌粒(同时带有质粒和单链噬菌体的特点)。
利用同一复制系统的两个质粒存在竞争。
(1)质粒载体的提取和纯化：
a) 培养细菌；
b) 收集和裂解细菌；
4℃，10min：>15kb，较柔和的转速，先加入糖、酶和 EDTA，然后加入去污剂；<15kb，用较剧烈的转速，
直接加入 SDS 之类去污剂或加热。
c) 纯化质粒 DNA：氯化铯(CsCl)-溴化乙锭梯度密度离心。
小质粒载体可用商业工具，或碱裂解法。
二、重组 DNA 技术(克隆)
(一)克隆(Cloning)
为什么操纵 DNA？
(1)改变细胞或组织的行为； (2)剥夺细胞或组织特定的基因(knock-out)；
(3)获得某种蛋白质； (4)获得特定的 DNA 序列；
(5)构建组织基因组的片段文库。
1. 重组 DNA 形式
(1)从供体分离的 DNA 酶裂解后，与另一 DNA 分子(克隆载体)连接；
(2)该克隆载体-插入 DNA 结构转移至宿主细胞，并在宿主细胞发挥功能；(转移至宿主菌称转化)
(3)筛选表达有外源基因的宿主细胞； (4)分离克隆基因表达的蛋白产物。
下面是一些限制性内切酶：
粘末端：EcoRI (G|AATTC)、BamHI (G|GATCC)、PstI (CTGCA|G)；
平末端：HpaI (GTT|AAC)、NotI (|GCGGCCGC)。
2. 分子克隆重要性
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15. 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bin.co/)
(1)克隆生成大量的纯 DNA，如基因，可以进一步用来印迹、测序、突变、转化细胞；
(2)基因组文库包含组织中所有 DNA 序列的拷贝；常可用来分离特定的基因、研究基因组构成；
(3)可从染色体库中分离某条染色体，如果某个基因已进行染色体定位，可以较方便地从该染色体中分离该
基因。
(二)重组 DNA 的载体
克隆：从组织中获得并剪切的 DNA 片段与克隆载体连接成重组 DNA 分子，然后转移至宿主细胞，
并利用宿主细胞复制系统进行复制。
载体根据目的不同可分为以下几类：
1. 克隆载体(Cloning Vector)
(1) 质粒克隆载体(下左)
细菌质粒是染色体外的环状双链 DNA 分子，可进行独立复制。以大肠杆菌质粒 E. Coli 为例，质粒克
隆载体必须具备以下三个特征：a) 一个复制起始序列 ori；b) 选择性标记位点(如抗氨苄青、抗四环位点)；
c) 限制性内切酶酶切位点。
(2) λ 噬菌体克隆载体
最常使用的噬菌体克隆载体即 λ 噬菌体克隆载体，该载体染色体“左”臂和“右”臂包括溶菌所必
须的基因，两个臂之间的部分可以“任意使用” ，常用来作为克隆位点。
(3) 柯斯质粒(cosmid)克隆载体
cosmid (cos site-carrying plasmid)，原指带有粘性末端位点的质粒。所谓柯斯质粒其实是一类由人工构
建的含有λDNA 的 cos 序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体 。特点：
a) 具有λ噬菌体的特性。柯斯质粒载体在克隆合适长度外源 DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒后，可
高效转染λ噬菌体敏感大肠杆菌寄主细胞，并能按照λ噬菌体 DNA 同样的方式环化。
b) 具有质粒载体的特性。柯斯质粒载体具有质粒复制子，因此能像质粒 DNA 一样在寄主细胞内进行复制，
并且能在氯霉素作用下，获得进一步扩增。此外，柯斯质粒载体通常也都具有抗菌素抗性基因，可供作重
组体分子表型选择标记，其中有一些还带上基因插入失活的克隆位点。
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16. 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bin.co/)
c) 具有高容量的克隆能力。柯斯质粒载体的分子仅具有一个复制起点，一两个选择记号和 cos 位点等三个
组成部分，其分子量较小，一般只有 5~7kb 左右。因此，可以插入到柯斯质粒载体上并能被包装成λ噬菌
体颗粒的最大外源 DNA 片段，即柯斯质粒载体的克隆极限可达 45kb 左右。
(4) 穿梭载体(shuttle vectors)
既可转化培养的哺乳动物细胞，又可以转化动物细胞、植物细胞、酵母细胞及其它细胞的这些载体，
通常是穿梭载体，即可以转化两种或更多不同宿主细胞的载体。
Yip(Yeast Integrating Plasmids)：包含重组序列，可被整合至酵母染色体，较稳定；
YRp(Yeast Replication Plasmid)。
(5)酵母人工染色体(Yeast Artificial Chromosomes, YACs)
YACs 是克隆载体，允许重组人工染色体并克隆至酵母宿主细胞。YACs 是线性载体，具有以下特征：
a) 染色体每一端具有酵母染色体端粒；b) 酵母中心粒序列；c) 每一臂上具有选择性标记位点(如 TRP1、
URA3)；d) 自主复制序列起始点(允许载体在酵母宿主细胞中复制)；e) YAC 独特的 RE 位点，允许插入外
源 DNA 片段(up to about 500kb)。
(6)细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome, BACs)
BACs 可以克隆较大的 DNA 片段(up to about 200kb)，BACs 包括天然质粒的复制起始点(F factor)，一
个多克隆位点(MCS)、一个选择性标记位点及其它位点。
2. 表达载体(Expression Vectors)
基因克隆的主要目的是对克隆的基因进行表达，而克隆载体中插入的基因不能确保被成功的表达。许
多特殊的表达载体被设计用来表达克隆的基因。这些通过操纵一系列的控制转录、翻译、蛋白质修饰和分
泌的基因元件来实现。
a)相关的转录启动子及终止序列；b) 结合核糖体的能力；c) 克隆基因的拷贝数，及该克隆基因是在质
粒中，还是整合到宿主基因组中；d) 所合成的蛋白质的最终细胞定位；e) 宿主组织中翻译的效率；f) 克
隆基因所表达的蛋白质在宿主细胞中的稳定性。
(1)基因表达载体最基本的要求： 克隆基因上游必须具有较强的并可调节的启动子。如来源于 E. Coli. 的 lac
L
和 lacUV5、来源于 lambda 噬菌体的 trp 和 p 等。
(2)一些融合蛋白系统常用来促进从 E. Coli 中纯化外源蛋白。如 His tail、MBP、GST 等。
基因融合就是将两个或多个 ORF 按一定顺序联接在一起，融合阅读框架的表达产物是一个杂合蛋白。
特点：a) 靶蛋白附着于已知酶功能和/或抗原组成的结构域，可以简化靶蛋白的标记与分离；b) 靶蛋白与
信号肽连接，可将融合蛋白分泌到特定的细胞区；c) 运载蛋白能保护靶蛋白免受原 Host 的蛋白酶解作用；
d) 运载蛋白可改善靶细胞的溶解性，防止形成不溶性包涵体。
大肠杆菌中合成的融合蛋白通常多是极好的免疫原，可以产生针对靶序列的抗血清。 但很多时候，
靶序列附加标签会有不利后果，可能丧失生物活性。
(3) 翻译表达载体：a) 一个选择性标记(如 ampr)；b) 一个启动子(tac)；c) 核糖体结合位点(lac Z)；d) 一个
ATG 翻译起始位点(核糖体结合位点下游约 8 个核苷酸)；e) 转录终止序列(来源于 lambda 噬菌体的 T1 和
T2)
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3. 定位载体(Targeting Vectors)
(1)逆转录病毒载体法：较有效的方法，但只能转移小片段 DNA(~8kb)；
(2) DNA 显微注射法：
优点：整合效率高，不需要载体，可转移达 100kb 左右的 DNA 片段；缺点：操作难，难以控制整合
位点。
4. 基因载体治疗
(1)体外基因治疗
a) 收集患者的细胞；b) 通过转移基因到分离的细胞中，纠正基因缺陷；c) 选择和培育基因纠正的细
胞；d) 将这些细胞回输到患者体内。
(2)体内基因治疗
直接将修补基因转移到患者体内。
5. 病毒载体系统
逆转录病毒载体：主要是缺陷型逆转录病毒载体。其中，最主要使用的是莫洛尼氏鼠白血病病毒
(Mo-MuLV or MMLV)；它为双链 RNA 病毒。
(1)Moloney 鼠白血病病毒
双链 RNA 病毒；利用其外壳蛋白和细胞膜上相应的受体，可以高效地感染细胞；两端是长末端重复
序列，中间含有包装信号及 gag、pol、env 分别编码核蛋白、逆转录酶及膜蛋白；整合到宿主细胞内，随
宿主细胞的增殖而稳定的传代。
优点：整合细胞染色体，稳定表达，感染广谱宿主细胞；
缺点：病毒滴度低，仅感染分裂细胞，外源基因容量小(<10kb)。
(2)腺病毒
优点：病毒滴度高，能感染非分裂细胞，感染广谱细胞；
缺点：不整合染色体，只能短暂表达，外源基因容量小(<10kb)，体内易产生抗体。
(3)腺辅助病毒
优点：无致病性，定点整合在第 19 对染色体；
缺点：感染效率低，外源基因容量小。
(4)单纯疱疹病毒
优点：神经细胞特异性表达，外源基因容量大(30)，病毒滴度高，非整合载体，但可在细胞内长期存
在，稳定表达；
缺点：对宿主细胞产生毒性，表达水平低。
PART B. 基因克隆(Gene Cloning)
一、重组 DNA 文库
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(1)基因组 DNA 文库：存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的至少包含每个基因组 DNA 片段一个拷贝
以上的集合。
(2)染色体文库：包含每个染色体片段的集合。
(3)cDNA 文库：以 mRNA 为模板，利用反转录酶合成的与 mRNA 互补的 DNA(cDNA)，再复制成双链 cDNA
片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得 cDNA 文库(包含了细胞表达的各种 mRNA 信息)。
1. cDNA 克隆
(1) cDNAs: what are they, how are they isolated, and what are they used for ?
相对 RNA 而言，DNA 较易被克隆、分析、稳定和操纵(制备、突变…)。
(2) 分离 mRNA：oligo dT 亲和层析；
(3) 用来克隆 cDNA 的载体：质粒及 lambda 噬菌体(esp. lambda 噬菌体)
(4) cDNA 的制备：a) cDNA 合成；b) 用甲基化酶保护，避免被 RE 消化；c) 用 RE 消化；d) 连接。
(5) cDNA 文库筛选(screening)寻找感兴趣的克隆：杂交、抗体筛选、功能分析、提取和杂异杂交。
(6) 分离的 cDNA：序列分析、Northern blotting、基因结构和连接。
2. 基因组克隆和分析
(1) 基因组文库的制备
a) 用 RE 完全消化基因组 DNA，并将产生的 DNA 片段克隆对克隆载体；
b) 基因被分裂到片段中和大量重组 DNA 分子的问题，可以通过用适当的载体克隆长片段 DNA 最小化；
c) 产生适当大小的 DNA 片段建立 DNA 文库的另一途径是进行局部消化。进行蔗糖梯度离心或琼脂糖凝
胶电泳。
(2) 构建基因组文库为包括所有基因组 DNA 序列需要多少克隆？
(3)基因组克隆的分离
准备基因组文库通常使用 lambda 噬菌体(replacement vector)；部分消化基因组 DNA，片段选择在
15~20kb 左右；包装；琼脂糖培养皿铺板，用 cDNA 文库筛选。
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利用 DNA 探针对质粒或柯斯质粒基因组文库进行筛选，寻找特定的 DNA 序列：
(3)
(4) 分析基因组克隆(朱卫国老师下面的内容参考课件讲义)
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第三部分 基因克隆和功能分析、基因表达调控
后基因组时代：基因命名、基因功能、基因调节。
PART A. 基因克隆和功能分析
一、从基因到蛋白
(1)定位克隆 Positional Cloning；
(2)微阵列分析 Microarray Analysis
(3)差异显示 Differentiation Display
(4)序列基因表达测定 Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)
(5)酵母双杂交系统 Yeast Two-hybrid System
(6)噬菌体显示 Phage Display
1. 定位克隆
定位克隆，又称图位克隆。用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，
在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的 1 个具体位置的基础上，通过构建高密
度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并单明其功
能和疾病的生化机制。
定位克隆技术主要包括以下 6 个步骤：
a) 筛选与目标基因连锁的分子标记。
b) 构建并筛选含有大插入片段的基因组文库。 常用的载体有柯斯质粒(cosmid)，酵母人工染色体(YAC）
等。用与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库，得到阳性克隆。
c) 构建目的基因区域跨叠克隆群(contig)。以阳性克隆的末端作为探针基因组文库，并进行染色体步
行，直到获得具有目标基因两侧分子标记的大片段跨叠群。
d) 目的基因区域的精细作图。
e) 目的基因的精细定位和染色体登陆。
f) 外显子的分离、鉴定。
2. 微阵列分析
3. 差异显示
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4. SAGE
(1)两条原则
一是来自转录体特定位置的 9-10 bp 的核苷酸序列已含有足够的信息来确定转录体；二是通过对一个
克隆内一系列标签的测序并将这些标签联系起来，就可以对转录体进行一系列研究。
(2)基本
a) 锚定酶(anchoring enzyme, AE)，又称 4 碱基识别酶，该酶通常含有四碱基识别序列，并且每 256bp 切割
一次；如 N1a III。
b) 标签酶(tagging enzyme, TE)：在其识别位点 20bp 左右切割 DNA，产生平末端，如 Bsm FI。
c) 连接标签：每个克隆含 25~75 个标签，用来测序。
5. 酵母双杂交系统
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将编码某一蛋白 X 的 DNA 序列与 DNA 结构域 BD 的编码序列融合成一个杂交体，
将编码另一蛋白 Y
的 DNA 序列与 DNA 激活域 AD 的编码序列融合形成另一个杂交体，当两个杂交体共转化酵母细胞(此酵
母细胞含上游有 DNA 结合位点的报告基因)，若 X 与 Y 没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；
若 X 和 Y 可相互作用，则 BD 和 AD 靠近形成一个有效的转录激活因子，激活报告基因的转录。
6. 噬菌体显示
二、从蛋白到基因
(1)蛋白-蛋白相互作用；
(2)蛋白质组学
1. 蛋白-蛋白相互作用
(1)一般过程(上左)
(2)用 GST 融合蛋白进行 Pulldown 实验(上右)
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该实验是把 GST 作为探针蛋白，将 GST 融合蛋白先与溶液中的特异性搭挡蛋白结合，然后根据谷胱
甘肽琼脂糖球珠沉淀 GST 融合蛋白的能力，来确定相互作用的蛋白。
(3)癌症的蛋白质组检测
PART B. 基因的功能分析
一、基因功能分析
(1)序列和结构分析 Sequence and structure analysis
(2)细胞内定位 Cellular compartmentalization
(3)获得功能 Gain of Function
(4)失去功能 Loss of Function
(5)上游事件 Upstream events
1. 序列和结构分析
(1)保守序列；
(2)已知基因的同源序列
(3)已知结构域、模序的同源序列
2. 细胞内定位：细胞膜、细胞质、细胞核及其它亚细胞结构。
3. 获得功能
(1)表达和过表达；
(2)随机插入——转基因小鼠；
(3)定位插入——Knock in；
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暂时转染；稳定转染。
稳定表达；调节表达。
(4)调节表达(TET ON/OFF system)
E. Coli. 的四环素抗性(注：tetracycline 四环素；doxycycline 强力霉素)
(5)表型显示
动物：生长和发育；
系统/器官/组织：生长和发育；
细胞水平：生长和增生；其它行为学改变；形态学；
分子水平：目的基因表达的改变；信号转导途径的改变；下游基因的效果。
4. 失去功能
(1)活性的抑制
a) 特定的抑制剂；
b) 显性失活(右图)；
c)特定的抗体。
(2)表达的抑制。
a) 基因敲除(Knock out)
b) 反义核酸(anti-sense)
c) RNA 干扰(RNA interference, RNAi)
5. 上游事件
表达的诱导/抑制：
a) 细胞周期相关；b) 化学因素、生物学因素的影响
表达的调控：
a) 顺式作用元件；b)反式作用元件。
(1)转录因子的分析
a) 电泳迁移率分析；
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b) DNA 指纹分析；
c) 染色质免疫共沉淀。
(2)顺式作用元件
二、RNA 干扰
1. 转录后基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing，PTGS)
转录后基因沉默是一个古老的抵抗病毒和转座子的机制。
免疫：细菌、病毒 → 免疫记忆→ 免疫攻击；
PTGS：病毒、转座子 → RNA 分子 → 基因沉默。
(1)植物(共抑制，Co-suppression)：
矮牵牛花，查尔酮合成酶 → 合成花青素
(2)真菌(平静，Quelling)
脉胞菌白化变种，al-1 对于类葫萝卜素的生物合成至关重要，al-1 过表达时反而成为白色。
(3)人、飞行昆虫、哺乳动物(RNA 干扰，RNAi)
线虫(C. elegans)细胞分裂时不对称，分化成头部和尾部，par-1 突变以及 anti-sense 和 sense 核酸处理，
都产生对称性分裂。
2. RNA 干扰
(1)双链 RNA 比单链 RNA 更有效地产生干扰；
(2)有证据显示，RNA 干扰可存在于注射的动物及其后裔(持续几代)；
(3)每个细胞只需注射少量的双链 RNA 分子，说明在 RNA 干扰过程中存在催化和放大成份。
培养的果蝇细胞 → 转染特定的双链 RNA 分子 → 同源细胞 mRNA 水平降低 → RNAi 依赖 ATP，
但与 mRNA 翻译无关 → 双链 RNA 分子两条链都被切割成 23~25bp 左右的片段
内源性 SRC-1 RNAi: siRNA，小干扰 RNA 分子。
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3. RNA 干扰的机制
(1)降解 mRNA
骨牌酶(Dicer)的发现：
RNase III 家庭成员是少数对 dsRNA 特异的酶；对果蝇和杆菌线虫基因组的研究发现了三种 RNase III
家庭成员：
a) 常规的 RNase III，具有一个特有的 RNase III 模序及一个 dsRNA 结合域(dsRBD)；
b) Drosha，具有两个 RNase III 模序和一个 dsRBD。
c) 具有两个 RNase III 模序和一个氨基酸末端螺旋酶域。
骨牌酶家族：
果蝇：Dicer；线虫(C. elegans)：K12H4.8；哺乳动物：Helicase-MOI。
骨牌酶的作用(下左)
RNAi 是一依赖 ATP 的过程(下右)
骨牌酶与其它 RNase III 一样，以二聚体形式发挥作用。
酶相对 dsRNA 周期性滑行，每 22bp 左右切割一次。
(2)转录抑制
Secondary siRNA
Micro-RNA
(1)~19-24bp；(2)含量丰富；(3)由编码区产生；(4)在特定组织特定时间内表达(small temporary RNA)
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siRNA 与 stRNA 比较：
(3)翻译抑制
(4)染色体重排
4. RNAi 的应用
(1)研究基因功能的新工具：由于 RNAi 具有高度的序列专一性和有效的干扰活力，可以特异地使特定基因
沉默，获得功能丧失或降低突变，产生类似基因敲除的效应，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的
研究工具。
(2) 用于病毒感染、肿瘤及遗传疾病的治疗。
PART C. 基因表达的调控
一、基因转录的调控
补充 A：真核基因组的结构特点：
(1)真核基因组结构庞大；(2)单顺反子；(3)重复序列；(4)基因不连续性。
补充 B：真核基因表达调控特点
(1)RNA 聚合酶；
RNA pol 有三种，即 RNA pol I II III；
每种 RNA 聚合酶大约 10 个亚基，其中有些亚基相同，如 TATA 盒结合蛋白(TBP)。
(2)活性染色体结构变化；
a) 对核酸酶敏感；b) DNA 拓朴结构变化；c) DNA 碱基修饰变化；如 5’侧翼区的 CpG 序列，低甲基
化时处于活化状态；d) 组蛋白变化。
(3)正性调节占主导；
真核 RNA pol 对启动子亲和力极小或根本没有实质性的亲和力。必须依赖多种激活蛋白的作用。
(4)转录与翻译分隔进行；
(5)转录后修饰、加工。
1.染色质重塑 Chromatin Remodeling
(1)ATP 依赖的物理修饰
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28. 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bin.co/)
如 DNA 拓扑结构的变化。DNA 天然状态以负性超螺旋构象存在，RNA pol II 前方的为正超螺旋，可
阻碍核小体结构的形成，促进组蛋白 H2A.H2B 二聚体的释放，使 RNA 可能前移并转录；其后方为负超螺
旋，利于核小体结构的再形成。
(2)化学修饰
组蛋白的乙酰化/去乙酰化；甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化、ADP-核糖基化、SUMO(泛素类蛋白
重要成员)化等。
(3) 组蛋白
组蛋白是高度保守的、小的、碱性蛋白。可分为 H1、H2A、H2B、H3、H4；其中各两分子的 H2A、
H2B、H3 和 H4 共同构成核小体的核心，称为组蛋白八聚体(又称核心组蛋白)，与 DNA 双螺旋缠绕在一
起构成核小体的核心颗粒；通过 H1 与 DNA 双螺旋组成的边接区相连接。
(4)ATP 依赖重塑复合体(ATP-dependent remodeling complex)
机制：a) Sliding in cis；b) Replacement in trans。
核 小 体 结合 诱 导 剂和 转录 元 件 的影 响 ： (a)
DNA 包装成核小体，通常认为可以阻碍转录，因
为核小体干扰诱导剂(绿色)或转录元件(蓝色)与
DNA 结合；(b) 核小体通过使两个一级结构不相邻
的 DNA 片段空间上空间，有利于转录；(c)核小体
可以使两个独立的诱导剂结合位点空间上邻近，从
而使诱导剂之间相互作用； (d) 核小体可以改变两
个因子之间的定向和距离关系。
ATP 依赖染色质重塑复合体：complex binding -> loosening -> complex escape and chromatin remodeling
(5)化学修饰
a) 保守赖氨酸(lysine)的乙酰化(组蛋白乙酰基转移酶(HAT))
b) 组蛋白甲基转移酶(HMT)
(6)“组氨酸密码”假说
a) 同一或不同组蛋白尾巴的修饰相互依赖，并形成每一个核小体不同修饰的组合；
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b) 组蛋白尾巴不同的修饰将导致与染色质相关蛋白不同的亲和力。
2. 转录元件 Transcription Apparatus
— ——//GCGC—CAAT—TATA—ATG— — — —AATAAA—//- —
— ——————— ————————— — — ——————— —
起始点上游-30bp 左右多数有共同的 5’-TATA 序列，称为 TATA 盒。
启动子、增强子的功能和位置区别。
(1)核心启动子 Core promoter
转录因子激活的基因转录
TFII D 辩认结合 TATA 盒，TFIIA 稳定 TFIID 的结合，TFIIB 促进 RNA pol II 的结合，TFIIF 解旋酶，
TFIIE 为 ATPase，形成转录起始前复合物(PIC)。TFIIH 磷酸化 RNA pol II 的 CTD。
(2)启动子和增强子 Promoter and enhancer
(3)RNA 聚合酶 II RNA polymerase II
(4)基本转录元件 Basal transcription machinery
RNA pol II + TFII D、A、B、F、E、H
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30. 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bin.co/)
(5)转录因子 Transcription factors
有基因转录因子(TF)和特异转录因子。
特异转录因子如：
Factor Sequence Motif Comment
c-Myc and Max CACGTG cell cycle regulators
c-Fos and c-Jun TGAC/GTC/AA AP-1
CREB TGACGC/TC/AG/A cAMP response element
NF-(kappa)B GGGAA/CTNT/CCC B- and T-cell factors
转录因子的结构域(模序)：
a) 同源结构区 Homeodomain
同源盒基 因（homeobox gene） 是控制发育的主要基因， 对动物的器官发生和细胞分化调控起关键作用。
同源盒基因含有一个共同的 180 bp 的序列，称为同源盒（homeobox） ，最早在果蝇中发现。进化上高度保
守。同源盒编码 60 个氨基酸的同源结构域（homeodomain，HD） 。含有 HD 的蛋白是转录因子，可激活或
抑制靶基因的表达。
b) 螺旋-环-螺旋 Helix-Loop-Helix (HLH)
螺旋-环-螺旋这类结构至少有两个α螺旋， 其间由短肽段形成的环连接， 两个这样的 motif 结构以二聚
体形式相连，距离正好相当于 DNA 一个螺距,两个α螺旋刚好分别嵌入 DNA 的深沟。
c) 锌指结构 Zinc finger
锌指结构由 1 个 alpha 螺旋和 2 个反向平行的 beta 折叠三个肽组成，N 端的 1 对半胱氨酸残基和 C 端
1 对组氨酸残基在空间上形成一洞穴，中间容纳一个 Zn2+，可稳定锌指结构。每一个单位可以其指部伸入
DNA 双螺旋的深沟，接触 5 个核苷酸。例如与 GC 盒结合的转录因子 SP1 中就有连续的 3 个锌指重复结
构。
d) 亮氨酸拉链 Leucine zipper
特点是蛋白质分子的肽链上每隔 6 个氨基酸就有一个亮氨酸残基，结果就导致这些亮氨酸残基都在α
螺旋的同一个方向出现。两个相同的结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结合成二聚体，这二聚体的另一
端的肽段富含碱性氨基酸残基，借其正电荷与 DNA 双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合。若不形成二聚
体则对 DNA 的亲和结合力明显降低。
e) 翼螺旋 Winged helix
(6)共激活剂/辅阻遏剂 Coactivators and corepressors
共激活剂：如染色质重塑蛋白：SWI/SNF、HAT、HMT。
辅阻遏剂：如 N-CoR、SMRT、BCoR。
(7) Mediators
哺乳动物的 Mediators，如：甲状腺素受体相关蛋白(TRAP)、维生素 D 受体相互作用蛋白(DRIP)、
ARC(Activator recruited cofactor)等。
Mediator 的功能证据：a) 与 co-activator 和 RNA pol II 相互作用；b) 激活转录；c) 增强基本转录：
d) 促进 TFIIH 磷酸化 RNA pol II 的 CTD。
3. 转录过程 Transcription Process
转录起始 Initiation → 启动子清除 Promoter clearance/escape/melting → 转录延长 Elongation → 加帽
Capping → 终止 Termination → 加尾(Poly A)Polyadenylation → 剪切 Splicing。
启动子清除：
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31. 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bin.co/)
mRNA 剪切：
a) 大多数内含子以 GU 为 5’末端起始，而 3’末端为 AG-OH，5’GU---AG-OH3’称为剪接接口；内含子
靠近 3’末端还有一甲基化的嘌呤， 为分支点； snRNA 与初级 mRNA 产物形成并接体； 并接体与 hnRNA
b) c)
结合；d)剪切过程通过两次转酯反应实现。
4. Regulation of Transcription
(1)核受体 Nuclear Receptors
(2)Wnt 途径 Wnt Pathway
(3)NFkB
(4)Fork Head Transcription Factors
《分子生物学基础》复习题
1. 设计 PCR 引物，PCR 扩增的条件，温度和时间？
2. 新克隆一个基因， 设计一些实验检验蛋白质相互作用？如何判定这些蛋白质相互作用是间接或直接的？
3. 基因活化时染色质重塑？组蛋白的甲基化？
附：DNA 甲基化材料
核小体核心由组蛋白 H2A、 H2B、 、 各 2 分子形成的八聚体和在八聚体上缠绕 1.75 圈的 146bp
H3 H4
DNA 所组成。每个核心组蛋白都有两个结构域：组蛋白的折叠区与组蛋白间相互作用及缠绕 DNA 有关；
氨基末端结构域，此结构像一条“尾巴” ，位于核小体核心结构以外，可同其他调节蛋白和 DNA 作用。染
色体的高级结构和基因的转录调控都与组蛋白密切相关，核心组蛋白的尾部通常有很多“信号位点” ，这
些位点常被组蛋白乙酰转移酶、 组蛋白磷酸转移酶、 组蛋白甲基转移酶作用。比如，组蛋白 H3 中的第 9 位
赖氨酸(表示为 H3K9 ,下同) 和 H3K4 常常是组蛋白甲基转移酶的作用位点。
每个组蛋白都有进化上保守的 N 端拖尾伸出核小体外。这些拖尾是许多信号传导通路的靶位点，从而
导致转录后修饰。
近来, “组蛋白密码” ]假说指出预先存在组蛋白尾部的修饰会影响随后的各种修饰,并且所有尾部区域
的修饰能作为一种记号，这些记号可以促使一些非组蛋白蛋白(如 HP1 或者 NuRD) 和蛋白复合体的聚集，
进而调节染色质的多种功能，如基因表达、DNA 复制和染色体分离等。
1 组蛋白甲基转移酶
追踪大量组蛋白序列发现，H3K4 、H3K9 、H3K36 、H4K20 都是易发生甲基化的位点，除此之外，
实验发现精氨酸也可以被甲基转移酶作用[ 4 ] 。一般认为,组蛋白只有赖氨酸和精氨酸是甲基转移酶的作
用位点。
催化精氨酸(Arg) 甲基化的酶被通称为蛋白质精氨酸甲基转移酶(protein arginine methyltransferase ,
PRMT) 家族，这类酶主要催化甲基从 S-酰苷甲硫氨酸向精氨酸中胍基氮的转移。
催化赖氨酸(Lys) 甲基化的酶被通称为含 SET ( Su(var)，Enhancer of zeste，Trithorax) 结构域的家族。
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32. 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bin.co/)
2. 组蛋白脱甲基酶
研究人员发现一种在细胞调节基因开启和关闭过程中起重要作用的酶。这种新型的酶能够协助安排基
因活动模式，这种模式进而决定正常的细胞功能。
发现的这种酶是一种组蛋白脱甲基酶，它能将加在与 DNA 结合的组蛋白上的甲基移走并帮助调节基
因的活动。
已经知道一些组蛋白标签（尤其是乙基）很容易添加和移除，这些标签帮助基因适时开启和关闭。但
是甲基的添加被认为只能通过组蛋白的破坏或替代才能被逆转。导致这种观点的部分原因是一直没能分离
到一种脱甲基酶。
这种酶并不能从组蛋白移走所有甲基，它只移走一种非常特殊的、 在组蛋白 3(H3)的赖氨酸 4(K4)上的
甲基。H3K4 甲基化与转录有关，因此这个基团的移除与这种基因功能抑制相一致。
3 DNA 甲基化与组蛋白甲基化之间的桥梁
DNA 甲基化在基因沉默中的作用已经被了解很久，但是 DNA 甲基化与组蛋白甲基化之间的关系直到
去年才发现。去年发现在脉胞菌（Neurospora）中，如果将一个广泛分布并保守的 Su(var)-like 甲基化转移
酶和组蛋白 H3 的 9 位酪氨酸突变，则能将所有的 DNA 甲基化作用去除。这说明组蛋白甲基化是在 DNA
甲基化的上游。Jackson et al.研究了在拟南芥菜中 Su(var)的同源物 KYP 发现，这种现象在植物中也是保守
的。
研究从寻找过度甲基化而导致花朵形状破坏的等位基因 SUPERMAN (SUP)的抑制因子开始，研究者
除了发现了已知的 DNA 甲基转移酶 CMT3（CHROMOMETHYLASE3）之外还发现了另一个基因 KYP，
KYP 包含有 Su(var)9-3 蛋白特别的 SET 结构域，此结构域与组蛋白 H3 的甲基化有关，KYP 也确实可以
将组蛋白的 9 位酪氨酸甲基化，序列分析在 KYP 突变体中 SET 结构域要么就被缩短了要么就消失了，这
说明此结构域是 KYP 功能所必须的。
因为在脉胞菌中 DNA 甲基化与组蛋白甲基化有密切联系， 研究者决定研究 KYP 的缺失功能突变体对
DNA 甲基化的作用。研究者研究了在突变体中在 CpNpG 位点被甲基化的基因 SUP，和在 CpG 岛大多被
磷酸化的位点 FLOWERING LOCUS WA，他们发现这些位点在 KYP 突变后大多不再被甲基化。
4. 染色质的转录活性与组蛋白修饰相伴
组蛋白乙酰化水平增加与转录活性增强有关，而组蛋白甲基化修饰的结果则相对复杂，它可以是转录
增强或转录抑制。
转录激活 转录抑制
乙酰化 增加 降低
赖氨酸甲基化 组蛋白 H3 K4 组蛋白 H3 K9，K27,K79
精氨酸甲基化 组蛋白 H3 R2,R17,R26 降低
组蛋白 H3 R4
表 1-组蛋白修饰与转录状态
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