Basic and principles of PCR and advanced PCR techniques. More details via sriprapun.m@gmail.com

1. Principle of PCR and applications
Methee Sriprapun, PhD
Division of Clinical Microbiology
Faculty of Medical Technology
Huachiew Chalermprakiet University
Email: sriprapun.m@gmail.com

2. PCR (polymerase chain reaction)
“การสังเคราะห์และเพิ่มจานวนชิ้นส่วน DNA ที่ต้องการในหลอด ทดลองอย่างต่อเนื่องเป็นลูกโซ่โดยอาศัยการเร่งปฏิกิริยาของ DNA polymerase ที่ทนความร้อน”
https://www.neb.com/~/media/NebUs/Page%20Images/Applications/DNA%20Amplification%20and%20PCR/pcr.jpg

3. PCR components
•DNA template
•Oligonucleotide primers (forward & reverse)
•Deoxynucleotide triphosphate (dNTPs)
- dATP, dTTP, dCTP, dGTP
•Buffer ที่มี Mg2+
•DNA polymerase : Taq polymerase
http://pbgworks.org/sites/pbgworks.org/files/user/25/eLib_PCR.png

4. DNA Template
•Extracted from cells or tissues
•Check purity of extracted DNA: A260/A280  1.7 – 2.0
•Using optimum concentration (เช่น 0.02-5g/50l)
Primers
http://mcdb4111.pbworks.com/w/page/20635666/Site-Directed-Mutagenesis
Forward & reverse primers
Optimum conc. :
0.1-1.0 M/rxn
“Nucleotide สายสั้นๆ (17-30 nt.) ที่เป็นจุดเริ่มของการสร้าง DNA
สายใหม่ในกระบวนการ PCR”

5. Deoxynucleotide triphosphate (dNTPs)
•Mixture of dATP, dTTP, dCTP and dGTP
•20-200 M
PCR buffer
•ทาให้ปฏิกิริยา PCR เป็นไปได้อย่างเหมาะสม
•Tris HCl, KCl, MgCl2
•Optimization of [Mg2+] is necessary  1.5-2.0 mM
•Mg2+  cofactor of Taq DNA polymerase
•มักถูกเตรียมในรูปของ 10X, 5X, 2X

6. •Taq polymerase : Thermus aquaticus (mostly used)
•Optimum conc. for PCR: 1 – 2.5 unit/rxn •Tth DNA polymerase (RT ในภาวะที่มี Mn2+, DNA polymerase ภาวะที่มี Mg2+) , Pfu DNA polymerase (มี proof reading activity)
DNA polymerase
http://www.biochem.arizona.edu/miesfeld/teaching/Bioc471- 2/pages/Lecture12/Lecture12.html

7. Enhancer & Inhibitor of DNA polymerase
Enhancer
Inhibitor
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Glycerol
Formamide
Bovine serum albumin (BSA)
Polyethylene glycol 6000 (PEG)
Tween 20
Gelatin
Phenol
Sodium dodecyl sulfate (SDS)
Proteinase K
Heparin
Porphyrin
EDTA

8. There are 3 steps of PCR
•Heat denaturation step: 90-95C
- DNA ต้นแบบสายคู่จะแยกออกจากกัน
•Primer annealing step: 40-60 C
- Primers จะจับกับสาย DNA บริเวณที่มีเบสคู่สมกัน
•Extension step: 70-75 C
- การเติมสาย nucleotide ต่อจาก primers ในแต่ละข้าง
ทิศทาง 5’  3’
- DNA polymerase activity ( Taq polymerase, Pfu polymerase, etc. )
http://www.caister.com/supplementary/pcr-troubleshooting/gifs/c1f1.jpg

9. http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrsteps.gif

10. Steps of PCR
http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrani.html

11. Steps of PCR (II)
http://www.biosistemika.com/uploads/PCR_sketch_4.jpg

12. 2n ; n = จำนวนรอบของ PCR
จำนวน PCR product =
> 20 cycles of PCR
> million of PCR products
cycles,  PCR product  PCR components
PCR product ใน cycle ท้ายลดลง
PCR product อาจจับกันเอง
การเพิ่มจานวนไม่เป็นแบบ 2n
“Plateau effect”

13. Amplification Plateau
http://www.biochem.arizona.edu/miesfeld/teaching/Bioc471-2/pages/Lecture12/AMG6.2b.gif
1. dNTP &  primers
2.Instability of dNTPs and Taq polymerase 3. End-product inhibition
4.Competitive reaction of non-specific product or primer-dimer
กำรแก้ไข: ปรับจำนวนรอบในกำรทำ PCR ให้เหมำะสม

14. กำรแบ่งประเภทของ PCR
PCR
Conventional PCR
Realtime PCR (qPCR)
Advanced PCR
- Endpoint detection
- realtime detection

15. •PCR preparation: equipment, reagents, place, etc.
•Following the instruction manual in reagent leaflet
•Isolation area : pre-PCR, PCR and post-PCR assays
•Scientist must know “Tm of primers”. Be careful of contamination !
Set up of Conventional PCR

16. PCR tube: 0.2 ml, 0.5 ml 1.5 ml tube: mastermix
PCR rack
PCR reagents
Storage: -20 C
PCR cooler box
Pipette tips
Autopipettes
Filtered tips

17. PCR cabinet
PCR machine
UV transilluminator or Gel doc

18. How to calculate mastermix
1x
เมื่อคานวณเทียบกับ
ปริมาตรที่ใช้ใน 1 rxn
-1x คือ 1 reaction ถ้ำ 10 reaction ต้องคำนวณ 10x
-สำมำรถ adjust สัดส่วน volume ได้แต่ต้องไม่น้อยเกินไป
-สูตรคำนวณที่ใช้คือ C1V1 = C2V2 (คำนวณ final concentration)

19. Ex. ต้องกำรเตรียม PCR mastermix 5 reactions จงแสดงวิธีกำรคำนวณ
เรำมักเตรียมเผื่อไปอย่ำงน้อย 0.5X หรือ 1X เพื่อป้องกัน pipette error
Reagents
1X (l)
5X (l)
Final conc.
2X Taq Master Mix
10
50
1X
10 M Forward primer
2.0
10
1 M
10 M Reverse primer
2.0
10
1 M
Nuclease free water
4
20
-
DNA template (25 ng/l)
2.0
-
50 ng (2.5 ng/l)
Total
20
แบ่งใส่ tube ละ 18 l + 2 l template DNA

20. PCR condition (example)
Pre denaturation: 94C 2 minutes
Denaturation: 94C 2 seconds
Annealing: 53C 30 seconds
Extension: 72C 1 minutes
Final extension: 72C 7 minutes
35 cycles
อาจปรับเปลี่ยนได้ตามความเหมาะสม แต่ annealing temp. ต้องดูให้ดี

21. Product size of PCR
Position แรก ของ nt. (F primer) – Position สุดท้าย ของ nt. (R primer)
เช่น จงคานวณ PCR product เมื่อใช้ primers ต่อไปนี้ A primer (forward) position: 988-1006 B primer (reverse) position: 2216-2196
988 1106
2196 2216
PCR product  2216 – 988 = 1,228 bp
(ดังนั้น Extension time ควรใช้เวลา..............นาที)

22. Primer optimization
Factors
ลาดับเบสของ primers
Base at 3’-end
Hairpin loop ใน primers
Primer dimer
%GC content
ความยาว primers
ค่า Tm
How to optimization
Complementary with DNA template
ควรมี G หรือ C จานวน 1-2 base (s)
หลีกเลี่ยงเบสคู่สมตั้งแต่ 3 bases ขึ้นไป ที่จับกันได้ใน primer สายเดียวกัน หลีกเลี่ยงเบสคู่สมตั้งแต่ 3 bases ขึ้นไป ที่จับกันได้ระหว่าง primer 2 สาย
45-55%
18-30 bases
40-60 C และค่า Tm ของ primers 2 เส้น ไม่ควรห่างกันเกิน 2-3 C

23. Optimization of thermal cycle condition
Annealing temperature: ต่ากว่า Tm of primer  5 C
Cycles of PCR :  25-35 cycles
Optimum [Mg2+] = 1.5 – 2.0 mM
การเพิ่ม-ลด มีผลต่อการเพิ่มปริมาณ product
pH 8.3 Total volume: 10-100 l
Tm= 2 x (no. of [A+T]) + 4 x (no. of [G+C])
Optimization of Mg2+ concentration
Optimization of pH in reaction

24. Optimization of dNTP concentration
Optimization of Taq polymerase
20-200 M
1-2.5 unit/reaction
Controls in PCR assay
Positive control: template ที่สามารถจับกับ primers ได้แน่นอน
Negative: template ที่ primers ไม่สามารถจับได้
NTC (No template control): PCR mastermix only ! (No adding of template)  จัดเป็น negative control แบบหนึ่ง *อย่างน้อยควรมี positive และ NTC controls

25. PCR product detection
•Agarose gel electrophoresis เทียบกับ DNA marker
•Stained with 0.5 g/ml ethidium bromide •นาไปส่องดูด้วยเครื่อง Ultraviolet (UV) transilluminator หรือ GelDoc
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/
commons/6/60/Gel_electrophoresis_2.jpg
http://bioprep.community.uaf.edu/ files/2013/07/gel1.jpg

26. •To separate DNA fragment or PCR product
•Agarose gel electrophoresis
•Polyacrylamide gel electrophoresis
Electrophoresis of DNA or PCR product

27. Agarose & polyacrylamide gels
Polyacrylamide gel (Vertical gel electrophoresis)
http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/Techniques/gelelectrophoresis.gif
Agarose gel (Horizontal gel electrophoresis)
http://media-2.web.britannica.com/eb-media/72/47672- 004-4E16B61F.jpg

28. Difference ???
•Agarose gel electrophoresis
อ่ำนำจกำรจ่ำแนกจะต่ำ (bp ต่ำงกันน้อยๆ จะแยกยำก)
สำมำรถแยกได้ช่วงกว้ำงกว่ำ (200 bp – 5 kb)  vary gel conc.
ถ้ำแยกขนำดใหญ่ pulsed-field gel electrophoresis
•Polyacrylamide gel electrophoresis
อ่ำนำจกำรจ่ำแนกสูง (แยกขนำดต่ำงกัน 1 bp ได้)
ใช้แยกขนำด DNA ขนำดเล็ก (5-500 bp)
Gel เตรียมยำก ถือยำก แตกหักง่ำย เปรำะบำง

29. % of agarose gel electrophoresis
http://abe.leeward.hawaii.edu/Protocols/DNA%20Gel%20Preparation%20and%20Electrophoresis.htm

30. Agarose gel electrophoresis
Running buffer
อำจใช้ 1XTBE,
1XTAE
หรือ 1xTPE
Gel chamber, gel cassette and comb
Power supply
Agarose powder
PCR product
DNA loading dye and DNA marker

31. How to prepare gel electrophoresis
http://sciencefair.math.iit.edu/techniques/gelelectrophoresis/

32. http://www.addgene.org/plasmid_protocols/gel_electrophoresis/
http://sciencefair.math.iit.edu/techniques/gelelectrophoresis/
http://ocw.mit.edu/courses/biological-engineering/20-109- laboratory-fundamentals-in-biological-engineering-fall- 2007/labs/mod1_2_photo.jpg

33. Gel electrophoresis
•Agarose gel electrophoresis (% gel ขึ้นกับขนาด PCR product และความละเอียดในการแยก band)
•% gel สูงๆ เหมาะกับงาน multiplex
•DNA marker
•Loading buffer or loading dye (6X)
•PCR product

34. Dye for staining PCR product
•Ethidium Bromide
•SYBR Green I : not recommended for in-gel staining เพราะ dye มีผลต่อ migration of DNA on gel •SYBR Gold: ราคาแพง แต่ sensitivity สูงกว่า EtBr and SYBR Green I
Staining processes
Pre staining method
Post staining method
In-gel staining method

35. Reminder !!!
•DNA เคลื อนที จำกขั้วลบไปบวก
•PCR product ขนำดเล็ก (bp น้อย) เคลื อนที เร็วกว่ำ
•Agarose gel electrophoresis:
“submarine gel electrophoresis”
•เติม buffer ก่อนจึงค่อยโหลด sample + loading dye ลง gel
ระวัง : ห้ำมต่อสำยไฟผิดขั้ว !!!
1kb 800 bp 250 bp 100 bp

36. Reminder !!! (II)
•ใช้ buffer ชนิดเดียวกันในกำรเตรียม gel และ rug gel เสมอ
•อย่ำลืมผสม PCR product กับ loading dye ก่อนโหลดใน well
•อย่ำลืมใส่ DNA marker ก่อนที จะ run gel
•ปิดฝำ gel chamber ก่อนเสียบสำยไฟและเริ มเปิด power supply เพื อ rug gel
•0.5 g/ml ethidium bromide in DW 15 นำที จำกนั้น destaining ด้วย DW 5-10 นำที ส่องด้วย UV transilluminator or Gel Doc
Visualization of PCR product on gel

37. เกร็ดความรู้
•Salt in electrophoresis buffer: preserve PCR product during gel electrophoresis
•In 6X loading dye
- glycerol,sucrose or ficoll: ท่ำให้ DNA หนักขึ้นและจมใน well
- สีใน loading dye : ติดตำมกำรเคลื อนที ของ PCR product
•สีที่ใช้ใน loading dye:
อำจใช้ 1 สีหรือหลำยสีก็ได้

38. Interpretation of gel electrophoresis
ตรวจดูว่า marker lane ชัดเจนหรือไม่
Gel มีตะกอนของ EtBr หรือไม่
มี Band บน Gel หรือไม่
No band !
-Repeat gel electrophoresis
-Error in PCR process
มี band !
ดูว่า Negative (NTC) ขึ้นหรือไม่
Positive control ขึ้นหรือไม่
Negative sample ขึ้นหรือไม่
จากนั้นจึงอ่านผลใน
band sample
•ถ้า NTC มี band  Contamination !
•ถ้า positive ไม่ขึ้น ไม่ควรออกผล
•ถ้า negative sample ขึ้น primers ไม่จาเพาะ (จับกับยีนอื่นได้) ต้องทา PCR ใหม่หรือหาสาเหตุว่าเกิดจากอะไร

39. You must know !
•Advanced PCR
 RT-PCR
 Multiplex PCR
 Nested PCR
•Real time PCR (qPCR)
http://en.wikipedia.org/wiki/Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction

40. RT-PCR
•Reverse transcription polymerase chain reaction
•Template: RNA
•Using reverse transcriptase enzyme ( RNA  cDNA)
•One step & two step RT-PCR
Reverse transcriptase ที่นิยมใช้
AMV reverse transcriptase ( Avian myoblastosis virus)
MMLV reverse transcriptase (Moloney murine leukemia virus)
http://www.gene-quantification.de/real-time-opt-1.gif

41. How to generate cDNA
•Using primer for cDNA synthesis (First strand synthesis)
http://worldwide.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/pcr- amplification/~/Media/Images/Resources/PAGuide/1439MA04_6A.ashx
1. Random hexamers
2. Oligo dT primer
3. Sequence-specific primer (นิยมใช้ reverse primer)

42. Flowchart of RT-PCR
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction.jpg
Enzyme: AMV or MMLV
Primer:
- Oligo dT
- Random hexamers
- Specific primer
Enzyme: Taq polymerese or Pfu polymerase, etc. Primer: Specific primers

43. One step & two step RT-PCR
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/8/80/One-step_vs_two-step_RT-PCR.jpg
-ทำใน 1 หลอด (RNA  PCR product)
-cDNA synthesis & PCR เกิดในหลอดเดียวกัน
-Using specific primers only !
ต้องทำ 2 ขั้นตอนแยกหลอดกัน

44. http://www.lifetechnologies.com/th/en/home/life-science/pcr/reverse-transcription/rt-pcr/one-two-step-rt-pcr.html

45. http://www.lifetechnologies.com/th/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/qpcr-education/1-step-vs-2-step.html

46. ข้อควรระวังในกำรทำงำนกับ RNA
•RNA degrade ได้ง่าย  place on ice, ระวัง RNase •Avoid RNase  สวมถุงมือทุกครั้ง, ใช้อุปกรณ์ที่เป็น RNase free เช่น Rnase free water, filter tips หรืออุปกรณ์ที่ treated ด้วย DEPC
•ระวังการปนเปื้อน genomic DNA
•หลีกเลี่ยง multiple freeze-thaw of RNA
•Keeping at -80C

47. Applications of RT-PCR
•Gene expression (mRNA detection)
•Virus detection (RNA viruses)
http://www.eurosurveillance.org/images/dynamic/EE/V13N30/H5N1_ Bulgaria_Figure1.jpg
http://diabetes.diabetesjournals.org/content
/51/4/1016/F3.large.jpg

48. Multiplex PCR
•เพิ่มจานวน target DNA หรือ cDNA หลายๆ ชนิดด้วย primers หลายคู่โดยทาใน PCR condition เดียวกัน
•Difference in PCR product sizes (at least 50 bp)
•Tm ของ primers แต่ละเส้นควรใกล้เคียงกัน
http://umfacts.um.edu.my/Gallery/
upload/prof_shamala/lab/lab.jpg

49. Applications of multiplex PCR
•ใช้ตรวจหาเชื้อก่อโรคต่างชนิดกันใน PCR เพียงหลอดเดียว
•ศึกษาการแสดงออกของยีนหลายๆ ชนิดในหลอดเดียวกัน
Template : DNA (multiplex PCR) Template: RNA (multiplex RT-PCR)

50. Nested PCR
•ใช้ primers 2 คู่ในการเพิ่มจานวน product เพียงชนิดเดียว
•เพิ่ม sensitivity and specificity
•Outer and Inner primers
http://www.mcb.uct.ac.za/Manual/pcropt7.gif
http://www.malariajournal.com/content/figures/1475-2875-12-74-1-l.jpg
http://openi.nlm.nih.gov/imgs/512/320/3116491/3116491_1743-422X-8-210-1.png

51. Multiplex RT-PCR
Nested RT-PCR
RNA
cDNA synthesis
PCR with many primer sets
RNA
cDNA
synthesis
PCR with Outer primers
PCR with
Inner primers

52. Real time PCR (qPCR)
•ตรวจติดตามและบอกปริมาณของ PCR product ที่เพิ่มในแต่ละ cycle ของปฏิกิริยา PCR ที่ดาเนินอยู่
•Fluorescent detection
•รวดเร็ว ไม่ต้องมีขั้นตอน gel electrophoresis
•ตรวจวัดช่วง Exponential phase
•Template RNA: qRT-PCR
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechQPCR.shtml
http://www.5prime.com/media/438079/wide%20dynamic%20range% 20and%20high%20sensitivity.jpg

53. PCR & qPCR
http://www.eppendorf.com/int/index.php?l=131&action=products&contentid=99&sitemap=2.5.1.5

54. กำรอ่ำนผล qPCR เบื้องต้น
•ดูจากกราฟ amplification curve และพิจารณาค่า Ct (cycle treshold)
•ถ้าระบบ SYBR Green ต้องดูคู่ Melting curve analysis
•Ct น้อยๆ  PCR product จะมาก
http://www.cambio.co.uk/library/images/html_images/arraypure_fig01.gif

55. Amplification curve
http://www.cgp-journal.com/2005%20issue%206/Quantitative%20Real-time.html
ตำแหน่งบนกรำฟ
ที่เริ่มวัดค่ำ fluorescence
ของ sample
Baseline: สัญญาณช่วงแรกของ PCR ที่มีการเปลี่ยนแปลง
fluorescent signal เพียงเล็กน้อย
Ct = cycle threshold or
crossing point
Ct: จานวนรอบ PCR
ที่กราฟของ signal ตัด
กับ threshold

56. Standard curve
-Absolute quantification เช่น viral load, gene quantitation
-Acceptable: R2  0.99, ค่า PCR efficiency เข้าใกล้ 100%
http://www.affymetrix.com/fa/images/usb_figures/75680_fig1.gif

57. qPCR instrument

58. Detection systems of qPCR
•ใช้สีย้อมที่เป็นสาร fluorescence
- Ethidium bromide, SYBR Green I, EvaGreen
- Binding with minor groove of dsDNA  extension step
- Non specific binding with dsDNA: non specific product,
primer dimer ???
- ความเข้ม fluorescence  ปริมาณ PCR product
- ข้อจากัด: ต้องมี PCR product เกิดชนิดเดียวเท่านั้น
ไม่เหมาะกับ multiplex qPCR

59. SYBR Green detection
http://www.intechopen.com/source/html/16794/media/image3.jpg
http://worldfoodscience.com/sites/default/files/5_0_0.jpg
SYBR Green จับ dsDNA แบบไม่จำเพำะ

60. Melting curve analysis
•ทาเมื่อใช้ detection system เป็น fluorescent dyes
•Similar to gel electrophoresis
•ใช้ตรวจสอบ specific PCR product
http://www.biolreprod.org/content/67/5/1465/F1.medium.gif

61. * Melting temperature สูง  PCR product ขนาดใหญ่
* Fluorescence signal สูง  PCR product มีมาก
Primer dimer
Orrù et al., BMC Infectious Diseases (2006)

62. Soliman RH et al., PUJ (2009)
Orrù et al. BMC Infectious Diseases 2006

63. Detection systems of qPCR (II)
•ใช้ติดฉลาก Hybridization probes or Probe detection
- Specificity > SYBR Green I
- Probe ติดฉลากด้วยสาร fluorescence
Probe คือ oligonucleotide สายสั้นๆ
ที่มีการติดฉลากสาร fluorescence (fluorophore)
http://www.bio.davidson.edu/courses/molbio/molstudents/spring2003/pierce/TaqmanprobeonDNA.jpg
ข้อดี : เพิ่มความจาเพาะ, ประยุกต์ใช้ multiplexing ได้,
ไม่ต้องทา melting curve analysis
ข้อเสีย : ราคาแพง, อาศัยผู้ชานาญ, อาศัยผู้ชานาญในการออกแบบ probe
เพื่อหลีกเลี่ยง probe mismatch กรณี template มี variation สูง

64. Probe detection
Various types of probe
•Taqman/Dual-labelled probes
•MGB Hybridisation probes
•Molecular Beacons
•AmpliFluor probes
•LUX (Light Upon eXtension) probes
•Yin-Yang (Displacement Hybridisation)
•Scorpions
•DNA Invader etc

65. Types of probe
•Hydrolysis probe: TaqMan probe
“ 5’3’ exonuclease of Taq polymerase
during extension step hydrolyzes probe
 Q ห่างจาก R
 เปล่งแสง fluorescence”
http://www.bio.davidson.edu/courses/molbio/molstudents/spring2003/pierce/TaqmanprobeonDNA.jpg
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Taqman.png

66. Taqman probe
(Koch WH, Nat Rev Drug Discov. 2004)
Probe เข้าจับกับ template ในช่วง
annealing step พร้อม primers
(probe อยู่ระหว่าง F และ R primers)
(probe จะจับที่ข้าง F หรือ R ก็ได้)
Extension step -มีการทางานของ Taq polymerase -การต่อสาย DNA จาก primers -Exonuclease activity ย่อย probe -Quencher ห่างจาก Reporter -จึงเกิดการเปล่งแสง

67. Types of probe (II)
•Hybridization probe: FRET (fluorescent Resonance Energy Transfer) LightCycler Probes
http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/life-science/custom-dna-probes/lightcycler-probes.jpg
“วัด signal ช่วง annealing”

68. FRET assay
http://www.bio-rad.com/en-cm/applications-technologies/pcr-primer-probe-chemistries
- Hybridization probe 2 เส้น ติดฉลาก
Fluorescence ต่างกัน 2 ชนิด
(Donor & Acceptor fluorophores)
Annealing step
-Primer & probe 2 เส้นจับกับ template ในบริเวณจาเพาะ
-Probe (D) อยู่ใกล้ probe (A) ในระยะเหมาะสม (1-5 nt.)
-เกิดการถ่ายเทพลังงานหลังจาก D ถูกกระตุ้นไปยัง A
-A เปล่งแสง fluorescence  ตรวจวัด
แสง
กระตุ้น D เปล่งแสง fluorescence
แสงนั้นไปกระตุ้น A
ให้ปล่อยแสงแล้วตรวจวัด
“Fluorescence Resonance Energy Transfer”

69. Molecular beacon
http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/beacon1.gif
“วัด signal ช่วง annealing”
http://www.sigmaaldrich.com/life-science/custom-oligos/dna-probes/product-lines/molecular-beacons.html

70. Pros & Cons of qPCR
ข้อดี
-ติดตามผลได้ขณะเกิดขึ้นจริง
-ไม่ต้องมี post PCR assay
-การทางานรวดเร็วกว่าแบบธรรมดา -มี specificity & sensitivity สูงและ reproducible ที่สุด -งาน RNA ใช้ RNA ตั้งต้นน้อยกว่า -ค่าใช้จ่ายใกล้เคียงกับ PCR แบบเดิม (เว้นค่าเครื่องมือ)
ข้อเสีย -อาจมีปัญหาในการทา multiplexing
-ต้องอาศัยความชานาญมากกว่า วิธีธรรมดา
-เครื่องมือราคาสูง -มี variation สูง เพราะวัดได้ ละเอียด

71. Applications of qPCR
•Gene expression
Absolute or relative quantification
•Gene detection
Detection of specific PCR product
Mutation detection
•Viral load

72. Rotor-Gene qPCR machine

74. PCR troubleshooting
•ไม่มี PCR product หรือมีน้อย
สำเหตุ
-Reagents / PCR machine
-Primers
-Annealing temperature
-Reaction เกิดไม่ดี
-Incomplete denaturation of DNA template - Presence of inhibitors
กำรแก้ไข
-ทา positive control
-Change primers
-Decrease temperature
-Mg2+, pH, [primers], [dNTPs], solvent optimization
-Increase temperature or time of denaturation - Purified DNA template

75. PCR troubleshooting (II)
•มี primer dimer มำก  PCR product น้อยหรือไม่มี
สำเหตุ
-คู่ primers มีเบสคู่สม
กำรแก้ไข
-เลือก primers ใหม่
-Annealing temperature and [Mg2+] optimization

76. PCR troubleshooting (III)
•Non-specific PCR products
สำเหตุ
-Non-specific primer binding
กำรแก้ไข
-annealing temperature
-Adjust [Mg2+] and pH
- primers and/or enzyme
-Using Hot Start PCR
http://www.biochem.arizona.edu/miesfeld/teaching/Bioc471-2/pages/Lecture12/Lecture12.html

77. PCR troubleshooting (IV)
•PCR product smear
สำเหตุ
-More PCR cycles
-Degradation of template
-Long extension time
-Denaturation at low temperature
-Enzyme, Mg2+, template มากไป
กำรแก้ไข
-PCR cycles
-Using new template
-ลดเวลา
-เพิ่มอุณหภูมิ
-ลด concentration

78. กำรลดกำรปนเปื้อนจำกขั้นตอน PCR
-Reduce false positive from exogenous sources
-Tips for better PCR assay
-Nucleic extraction, pre-PCR, PCR and post-PCR

79. Tips for better PCR
•Isolation area of pre-PCR, PCR and post-PCR
•Autoclave solution and PCR equipment
( primers, dNTP, Taq DNA polymerase)
https://www.roche-applied-science.com/campaigns/DeveloperTips/img/physical-separation.jpg

80. Tips for better PCR (II)
•Aliquot reagents : buffer, primers, DW, dNTPs
•Use disposable gloves: เปลี่ยนถุงมือบ่อยๆ
•ระวังสารกระเด็นตอนเปิดปิดฝา  ควร spin down ทุกครั้งก่อนเปิดฝา
•Use positive displacement pipettes with disposable filter tips
•เตรียม mastermix แยกหลอดแล้วนาเติมในหลอดที่มี DNA หรือควรเติม template หลังสุด
•เลือก positive & negative controls ให้เหมาะสม

81. Pros & Cons of PCR assay
•ไม่ต้องใช้ DNA ปริมาณมาก
•High specificity
•เพิ่มจานวนได้อย่างรวดเร็ว ภายในเวลาสั้นๆ เพียง 1-3 ชั่วโมง •DNA ที่เพิ่มจานวนมีปริมาณมาก พอที่จะนาไปศึกษาด้านต่างๆ ได้
•High sensitivity
•ต้องทราบลาดับเบสที่จะต้องใช้ ออกแบบ primers
•ต้องสังเคราะห์ให้เหมาะสมกับ การศึกษาในแต่ละเรื่อง •อาจเกิด false positive ได้ง่ายจึงต้อง มี negative control ร่วมเสมอ •อาจเกิด false negative ที่เป็นผลมา จากสภาวะของ PCR จึงต้อมี positive control ร่วมเสมอ
Pros
Cons

82. PCR applications
•Pathogen detection  bacteria, viruses, protozoa •วินิจฉัยความผิดปกติทางพันธุกรรม (genetic diseases)  sickle cell anemia, thalassemia, etc.
•วินิจฉัยโรคมะเร็ง เช่น CML: Ph’chromosome
• HLA typing : autoimmune diseases เช่น rheumatoid arthritis
•การหาลายพิมพ์ DNA ในมนุษย์ : PCR-RFLP
•Forensic sciences
•การปรับปรุงพันธุ์พืช สัตว์น้า เป็นต้น

83. •Research applications
- DNA sequencing, molecular cloning
- Genome mapping
- Evolutionary analysis, etc.
PCR applications (II)

84. เอกสำรอ้ำงอิง
•เอกสารประกอบการเรียนเรื่อง In Silico PCR-based assay design รายวิชา Fundamental Bioinformatics in Medical Sciences (3005718) ของผศ.ดร. สัญชัย พยุงภร ภาควิชาชีวเคมี คณะ แพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
•http://www.seedtechnology.net/docs/GT%20Superworkshop%20- %20Bascis%20of%20PCR%20%20TALK%20AF.pdf
•http://www.biochem.arizona.edu/miesfeld/teaching/Bioc471-2/pages/Lecture12/Lecture12.html
•http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html •เอกสารประกอบการเรียนเรื่อง Polymerase chain reaction (PCR) ของ ผศ.ดร. วนิดา นพพรพันธุ์ คณะสหเวชศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย •เอกสารประกอบประชุมเชิงปฏิบัติการ เรื่อง Introduction to Real time-PCR and its applications ของ ดร. อโณทัย โภคาธิกรณ์ •หนังสือ PCR Technology: ทฤษฎีและการประยุกต์ใช้ประโยชน์ของ ดร. วัชรี อัตถทิพพหลคุณ และคณะ ของคณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยมหิดล

85. เอกสำรอ้ำงอิง (II)
•หนังสือเวชศาสตร์โมเลกุล : Molecular medicine บรรณาธิการ สุรางค์ นุชประยูร, จินตนา จิรถาวร, ณัฎฐิยา หิรัญกาญจน์ ของคณะแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย •เอกสารวิชาการของ รศ. ดร. วีระพงศ์ ลุลิตานนท์ และคณะเรื่อง (สามารถอ่าน online ได้)
1. พื้นฐานเทคนิค Polymerase Chain Reaction
2. การออกแบบ PCR primers
3. พื้นฐาน Real Time Polymerase Chain Reaction
4. การลดและการป้องกันการปนเปื้อนในงาน PCR