1. PRUEBAS BIOQUÍMICAS Dra. Natalia Izurieta Cergneux PRÁCTICA No. 5 – LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA Y MICOLOGÍA

2. PRUEBAS BIOQUÍMICAS La identificación definitiva de una especie requiere de pruebas bioquímicas. Permiten conocer las actividades metabólicas y enzimáticas de los microorganismos.

3. PRUEBAS BIOQUÍMICAS Identificar los productos finales de los procesos metabólicos Se debe conocer: 1.- Cambios que se producen 2.- Reacciones químicas que ocurren 3.- Enzimas que intervienen 4.- Productos intermedios 5.- Secuencias de las reacciones bioquímicas

4. PRUEBAS BIOQUÍMICAS Los microorganismos se cultivan en medios S/D SS + SD PB Las pruebas bioquímicas disponibles para la identificación de microorganismos de la familia Enterobacteriaceae son: 1.- Pruebas IMVIC 2.- Prueba de TSI 3.- Prueba de Ureasa 4.- Movilidad

5. PRUEBAS IMVIC Incluyen un grupo de cuatro pruebas usadas para diferenciar a los microorganismos entéricos (Familia Enterobacteriaceae) Las pruebas son: INDOL ROJO DE METILO VOGES – PROSKAUER CITRATO.

6. PRUEBA DE INDOL FUNDAMENTO: TRIPTOFANASA H2O + TRIPTOFANO INDOL + AC. PIRUVICO + NH3 PROTOCOLO: Se inocula en caldo triptosa e incuba a 35 - 37°C durante 24 horas. Luego de este período, se añaden 5 gotas del reactivo de Kovacs. INTERPRETACIÓN: NEGATIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO

7. PRUEBA DE CITRATO CITRATO PIRUVATO Na2CO3 CO2 + Na + H2O AgarCitratado de Simmons Ph ALCALINO AZUL DE BROMOTIMOL PRUEBA + COLOR AZUL

8. PRUEBA DE CITRATO PROTOCOLO 1.- Se inocula el agar de superficie inclinada con una sola estría en la superficie. 2.- Se incuba a 35 - 37°C durante 24 horas y se realiza la lectura de la prueba.

9. PRUEBA DE CITRATO INTERPRETACIÓN: Es positiva cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, y este se acompaña o no de un viraje del indicador de verde a azul. El cambio de color del medio a azul indica una reacción positiva. POSITIVO NEGATIVO

10. PRUEBA DE ROJO DE METILO Y VOGES PROSKAUER

11. PRUEBA DE ROJO DE METILO FUNDAMENTO: FERMENTACIÓN ÁCIDO MIXTA GLUCOSA ÁCIDOS LÁCTICO, ACÉTICO Y SUCCÍNICO pH ÁCIDO + CO2, H2 y ETANOL 5 GOTAS ROJO DE METILO COLOR ROJO POSITIVO NEGATIVO

12. PRUEBA DE ROJO DE METILO PROTOCOLO: (caldo MRVP) 1.- Se Inocula el medio con un cultivo puro joven. 2.- Se incuba a 35 – 37°C durante 48 horas. 3.- Luego de terminado el tiempo de incubación se añaden 5 gotas del reactivo de Rojo de Metilo (no agitar). INTERPRETACIÓN: SIN INOCULAR NEGATIVO POSITIVO

13. PRUEBA DE VOGES PROSKAUER FUNDAMENTO: FERMENTACIÓN BUTILENGLICÓLICA GLUCOSA ACETIL-METIL-CARBINOL (ACETOÍNA) REACTIVO DE BARRETT KOH 40% 2-3 BUTANODIOL, ETANOL, H2 y CO2 POSITIVO NEGATIVO

14. PRUEBA TSI (TRIPLE SUGAR IRON) Medio S/D Permite evidenciar: Capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. Permite la identificación de la producción de SH2.

15. PRUEBA TSI Esta prueba tiene como objetivo diferenciar entre:

16. PRUEBA TSI FUNDAMENTO: El extracto de carne y peptona aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los HC fermentables. El rojo de fenol es el indicador de pH. Por la fermentación de los azúcares, se producen ácidos que se detectan por el indicador de pH.

17. PRUEBA TSI PROTOCOLO: 1.- Se inocula los tubos de TSI con punta. 2.- Se introduce la punta hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo. 3.- Luego de retirar el asadel fondo, se estría el pico con un movimiento en zigzag, de un lado al otro. 4.- Se incuba a 35 - 37°C durante 24 horas. INOCULACION CON PUNTA ESTRIACION EN ZIGZAG

18. PRUEBA TSI INTERPRETACIÓN: Se debe considerar los cambios de color en el pico y el fondo del tubo y la formación de burbujas. Cuando el medio es ácido (A) este se torna de color amarillo y cuando es alcalino (ALK) permanece de color rojo.

19. PRUEBA TSI El medio contiene 0.1% de glucosa y 1% de lactosa y sacarosa respectivamente. Si el microorganismo sólo fermenta la glucosa, el ácido producido en el fondo acidifica el medio en esa zona y se torna de color amarillo. Cuando el microorganismo fermenta la lactosa y la sacarosa, el ácido producido es suficiente como para virar el color del medio a amarillo. El medio permanece rojo cuando no se produce fermentación de ninguno de los azúcares.

20. PRUEBA TSI Si hay formación de gas durante el proceso de fermentación, en el fondo del medio se observan burbujas o la ruptura del agar. Si las bacteria son productoras de SH2 este se evidencia como un precipitado negro en el fondo del tubo.

22. PRUEBA DE LA UREASA FUNDAMENTO: UREASA UREA 2 MOLÉCULAS DE NH4 pH ALCALINO RESULTADOS ROJO DE FENOL + - COLOR FUCSIA

23. PRUEBA DE LA UREASA PROTOCOLO: 1.- Se siembra el microorganismo en estudio en caldo urea o agar úrea de Cristensen. 2.- Se incuba a 35 - 37° C durante 24 horas. INTERPRETACIÓN: NEGATIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO Agar Úrea de Cristensen