Minőség ellenőrzés * Élelmiszerek * Víz * Felületek * Levegő Mikroba-pusztulási és szaporodásgátlási vizsgálatok * Fertőtlenítőszerek hatékonyságának vizsgálata * Antibiotikumok szaporodásgátló hatásának vizsgálata * Tartósítószerek hatékonyságának vizsgálata Fermentációs iparok * Táptalaj optimalizálás Környezetvédelem * Baktériumok aktivitásának vizsgálata Tejipari alkalmazások * Nyerstej összcsíraszámának (mezofil aerob és fakultatív anaerob baktériumszám) meghatározása * Nyerstej Enterobaktérium számának meghatározása

1. 1

2. 2
A MICROTESTER GYAKORLATI
ALKALMAZÁSA
Dr. Szakmár Katalin
Budapest, 2012. február 15.

3. 3
Minőség ellenőrzés
• Élelmiszerek
• Víz
• Felületek
• Levegő
Mikroba-pusztulási és szaporodásgátlási vizsgálatok
• Fertőtlenítőszerek hatékonyságának vizsgálata
• Antibiotikumok szaporodásgátló hatásának vizsgálata
• Tartósítószerek hatékonyságának vizsgálata
Fermentációs iparok
• Táptalaj optimalizálás
Környezetvédelem
• Baktériumok aktivitásának vizsgálata
A MICROTESTER ALKALMAZÁSI
LEHETŐSÉGEI

4. 4
Tejipari alkalmazások:
• Nyerstej összcsíraszámának (mezofil aerob és fakultatív
anaerob baktériumszám) meghatározása
• Nyerstej Enterobaktérium számának meghatározása
A kétféle meghatározás – redox görbék eltérő
alakja miatt – egyszerre, egy táptalaj
alkalmazásával elvégezhető
MINŐSÉG-ELLENŐRZÉS
ÉLELMISZEREK

5. ENTEROBAKTÉRIUM ÉS ÖSSZCSÍRASZÁM
EGYIDEJŰ MEGHATÁROZÁSA
Nyerstej, 1/2 TSB (T=30 °C)
-400
-300
-200
-100
0
100
200
300
400
500
0 5 10 15 20 25
t (h)
Eh(mV)
0. hig. 1. hig. 2. hig. 3. hig. 4. hig
5. hig 6. hig 7. hig.

6. ENTEROBAKTÉRIUM ÉS ÖSSZCSÍRASZÁM
EGYIDEJŰ MEGHATÁROZÁSA
Nyerstej belső kalibrációs görbe
(1/2 TSB, T=30 °C)
y = 2,6486x + 1,34
R
2
= 0,9895
0
5
10
15
20
0 1 2 3 4 5 6 7
hígítás
TTD(h)
Összcsira Enterobacter
MPNEnterob.=2,3x102
/ml
MPNÖsszcsíra=2,3x106
/ml

7. MÓDSZEREK IDŐIGÉNYÉNEK
ÖSSZEHASONLÍTÁSA
Minta
Lemezöntés MicroTester
lgN Időigény (h) lg MPN Időigény (h)
1. 5,18 5,36
2. 5,06 5,36
3. 4,93 72 4,36 18
4. 6,35 6,36
5. 6,79 6,36

8. 8
Microtester Mini készülék alkalmazása:
• A készülék a termelőhöz kihelyezhető
• Kezelése viszonylag egyszerű
• Az adatok a tejbegyűjtés időpontjában leolvashatók
NYERSTEJ VIZSGÁLATA KÖZVETLENÜL A
TEJTERMELŐNÉL

9. MICROTESTER MINI KÉSZÜLÉK

10. 10
A MÓDSZER IDŐIGÉNYE
Nyerstej összcsíra kalibrációs görbéje
(1/2 TSB, 30 °C)
y = -1,5014x + 15,413
R2
= 0,9596
0
2
4
6
8
10
12
14
1 2 3 4 5 6 7 8 9
lgN /ml tej
TTD(h)

11. 11
SALMONELLA KIMUTATÁSA
Salmonella, tej, sajt, RVS
y = -1.524x + 15.3
y = -1.400x + 12.4
y = -2.268x + 19.8
0
5
10
15
20
0 2 4 6 8 10
lgN (cfu/cell)
TTD(h)
sajt tej RVS

12. 12
AZ RVS SZELEKTIVITÁSA
Mikroba
RVS
TTD (h)
RVS + 10% tej
TTD (h)
TSB
TTD (h)
Klebsiella
oxytoca
- - 6,5
Escherichia
coli
- - 1,6
Citrobacter
freundii
- - 2,5
Proteus
vulgaris
- - 14

13. 13
KÜLÖNBÖZŐ SALMONELLÁK
KALIBRÁCIÓS GÖRBÉI
Salmonella
y = -3.512x + 25.6
y = -4.604x + 35.8
y = -1.512x + 13.8
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8
lgN (cfu/cella)
TTD(h)
Salmonella Tiphymurium Salmonella Enteritidis Salmonella Abony

14. • MicroTester készülékkel a Salmonellák RVS
tápoldatban kimutathatók.
• Elődúsítás nem szükséges.
• A zavaró mikroflóra az RVS-ben nem szaporodik.
• Élelmiszerek (tej, sajt, stb.) a tápoldathoz adása a
kimutatási időt csökkenti, de a szelektivitást nem
befolyásolja.
• A Salmonella jelenlétének igazolása a
MicroTesterrel végzett mérés után, a gyanús
mintákból PCR-al elvégezhető.
SALMONELLA KIMUTATÁSA

15. LISTERIÁK KIMUTATÁSA
Listeriák redox görbéi (1/2 Fraser, 37 °C)
-400
-300
-200
-100
0
100
200
300
400
500
0 5 10 15 20 25
t (h)
Eh(mV)
L. monocytogenes L. innocua L. ivanovi

16. 16
EGYESÍTETT KALIBRÁCIÓS GÖRBE 1/2
FRASERBEN TEJJEL ÉS TEJ NÉLKÜL
Listeria monocytogenes TTD = -4.218.
lgN + 36.99
R2
= 0.9798
0
5
10
15
20
25
30
35
0 1 2 3 4 5
lgN (cfu/cella)
TTD(h)
1/2 Fraser 1/2 Fraser, tejjel

17. • Fraser levesben a listeriák jelenléte a szokásos
módszernél gyorsabban kimutatható.
• A táptalaj szelektivitását a hozzáadott élelmiszer
(tej) nem befolyásolja.
• A tejben leggyakoribb zavaró mikroba, az E. coli a
tápoldatban nem szaporodik.
• A Listeria monocytogenes jelenléte csak további
vizsgálatokkal (PCR) igazolható.
LISTERIA MONOCYTOGENES KIMUTATÁSA

18. Húsipari alkalmazások:
• Nyershús összcsíraszámának (mezofil aerob és
fakultatív anaerob baktériumszám) meghatározása
• Húskészítmények gyártásközi mikrobiológiai
minőségellenőrzése
MINŐSÉGELLENŐRZÉS
ÉLELMISZEREK

19. 19
NYERSHÚS ÖSSZCSÍRASZÁMA
Nyershús
y = -3.15x + 19.456
R2
= 0.965
y = -2.9427x + 20.293
R2
= 0.9897
y = -2.6833x + 20.498
R2
= 0.9633
y = -3.6081x + 26.46
R2
= 0.9851
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7
lgN (cfu/cella)
TTD(h)
marha sertés csirke darálthús

20. 20
2073/2005 EK RENDELET ELŐÍRÁSAI
Élelmiszer kategória Mikrobák n c m M
Hasított szarvasmarha,
juh, kecske, ló
Aerob mikrobaszám lgN=3,5 lgN=5,0
Hasított sertés Aerob mikrobaszám lgN=4,0 lgN=5,0
Darált hús Aerob mikrobaszám 5 2 5x105 5x106
Mechanikusan lefejtett
hús
Aerob mikrobaszám 5 2 5x105 5x106

21. KIMUTATÁSI IDŐK ÖSSZEHASONLÍTÁSA
Határértékek
(2073/2005 EK)
Kimutatási idők (h)
(N=cfu/g) Klasszikus Microtester
lgN=3,5
lgN=4,0 Hús
lgN=5 aerob mikrobaszám
lgN=5,7
lgN=6,7
72
10
9
6
5
2

22. HÚSKÉSZÍTMÉNYEK GYÁRTÁSKÖZI
ELLENŐRZÉSE
Húspép y = -0,54x + 8,5
R2
= 0,9637
0
2
4
6
8
10
0 2 4 6 8 10 12 14
TTD (h)
lgN(cfu/cella)

23. HÚSKÉSZÍTMÉNYEK GYÁRTÁSKÖZI
ELLENŐRZÉSE
Virsli gyártásközi vizsgálati eredményeinek
összehasonlítása
0
2
4
6
8
10
1 2 3 4 5 6
Minatvételi pont
lgN(cfu/g)
Lemezöntés Microtester

24. KIMUTATÁSI IDŐK ÖSSZEHASONLÍTÁSA
Mikrobaszám Kimutatási idő (h)
(N=cfu/g) Lemezöntés Microtester
lgN=6,1
lgN=7,6
lgN=6,8
lgN=5,8
lgN=7,6
lgN=7,5
72
7
4
5
7
4
4

25. • Üdítőitalok penész- és élesztőgomba
számának meghatározása:
– Indirekt mérés (a szaporodás során képződő CO2-ot KOH
oldatban nyeletjük el és a KOH oldat redox-potenciál
változását mérjük)
MINŐSÉGELLENŐRZÉS
ÜDÍTŐITALOK

26. INDIREKT MÉRŐCELLA

27. 27
INDIREKT MÉRÉS REDOX-GÖRBÉI
Saccharomyces cerevisiae
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50
t (h)
Eh(mV)
lgN=4.1 lgN=3.1 lgN=2.1
lgN=1.1 lgN=0.1 steril

28. 28
PENÉSZ- ÉS ÉLESZTŐGOMBA
KALIBRÁCIÓS GÖRBÉI
Aspergillus niger
TTD(h) = -7.569.
lgN + 60.7
R2
= 0.9677
20
30
40
50
60
70
0 1 2 3 4 5
lgN (cfu/cella)
TTD(h)
(detektációs kritérium: dE/dt=0.2 mV/min)
Saccharomyces cerevisiae
(detektációs kritérium: dE/dt=0.2 mV/min) TTD(h) = -7.2048
.
lgN + 41.3
R2
= 0.9856
0
10
20
30
40
50
0 1 2 3 4 5
lgN (cfu/cella)
TTD(h)

29. • Ivóvíz mikrobiológiai szennyezettségének gyors
kimutatása
• Ásványvíz mikrobiológiai gyártásközi
minőségellenőrzése
• Kezelt víz (pl. ioncserélt víz, R.O. víz, stb.) gyors
mikrobiológiai vizsgálata
• Fürdővizek mikrobiológiai állapotának gyors
vizsgálata
• Szennyvizek gyors mikrobiológiai vizsgálata
MINŐSÉGELLENŐRZÉS
VÍZ

30. KIMUTATÁSI IDŐK ÖSSZEHASONLÍTÁSA
VÍZ
Határértékek
Kimutatási idők (h)
Klasszikus
módszer
Microtester
(1000 ml)
Összcsíra 22 oC (100 cfu/ml)
37 oC (20 cfu/ml)
72
22 (1 ml)
10 (1 ml)
15
4
Coliform (1/100 ml)
Escherichia coli (1/100 ml)
24
10 (100 ml)
11 (100 ml)
9
10
Ps. aeruginosa (1/100 ml)
Enterococcus (1/100 ml)
48
20 (100 ml)
14 (100 ml)
18
12

31. 31
ÁSVÁNYVÍZ VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEI
Mikroba
Egy sejt kimutatásához szükséges
vizsgálati idő (h)
Escherichia coli 11
Citrobacter freundii 23
Pseudomonas aeruginosa 24
Enterococcus faecalis 15

32. 32
ÜZEMI ELLENŐRZŐ VIZSGÁLATOK 1.
TYLICZ (TÉTELMINŐSÍTŐ VIZSGÁLAT)
Egy membránon 3 x 250 ml-t szűrtünk, egy mérőcellába 4 membránt
tettünk (egy mérőcellában egyszerre 12 palack minőségét ellenőriztük)
Palackok
sorszáma 1-12. 13-24. 25-36. 37-48. 49-60. 61-72.
Laboratóriumi
mérés
eredménye
negatív negatív negatív negatív negatív negatív
Microtester
mérés
eredménye
negatív negatív negatív negatív negatív negatív

33. 33
ÜZEMI ELLENŐRZŐ VIZSGÁLATOK 2.
(Zalaszentgrót, Hoffmanné & Tar-Géri, 2008)
Vizsgált
mikroba
Összes
mérés
(db)
Egyezés a
szabványos
vizsgálattal (%)
Fals pozitív
eredmény
(%)
Fals negatív
eredmény
(%)
Escherichia coli 942 99,89 0,11 0,00
Coliform 4674 99,87 0,00 0,13
Enterococcus 3000 99,93 0,00 0,07
Pseudomonas
aeruginosa
3372 99,82 0,06 0,12

34. TERMÉSZETES FÜRDŐVÍZ
Velencei tó (Agárd strand)
y = -0.8416x + 11.565
R2
= 0.9871
y = -0.299x + 4.7342
R2
= 0.9917
-1
0
1
2
3
0 5 10 15 20
TTD (h)
lgN(cfu/100ml)
Enterococcus E.coli

35. 35
VIZSGÁLATI EREDMÉNYEK
ÖSSZEHASONLÍTÁSA
Escherichia coli (Agárd strand)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
1 2 3
minta sorszáma
lgN(cfu/100ml)
Microtester
Plate (Szfv.)
OKI

36. 36
Enterococcus (Agárd strand)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
1 2 3
minta sorszáma
lgN(cfu/100ml)
Microtester
Plate (Szfv.)
OKI
VIZSGÁLATI EREDMÉNYEK
ÖSSZEHASONLÍTÁSA

37. 37
• Szennyvíz (Coliform: 10 cfu/ml)
– Nagyobb mennyiség (100, 1000 ml) szűrésével a vizsgálati
idő lerövidíthető
• Szennyvíziszap mikrobiológiai ellenőrzése
TOVÁBBI LEHETŐSÉGEK

38. 38
MÉRŐCELLA KÉT MEMBRÁNNAL

39. 39
SZENNYVÍZ MÉRÉSI EREDMÉNYEI
Szennyvíz, coliform
y = -1,1554x + 9,7
R2
= 0,9788
0
2
4
6
8
10
0 2 4 6 8
lgN
TTD

40. • Felületek ellenőrzése (tamponos vizsgálattal)
• Levegő mikrobiológiai tisztaságának
ellenőrzése (membránszűréssel)
MINŐSÉGELLENŐRZÉS
HIGIÉNIAI VIZSGÁLATOK

41. 41
TAMPONOS VIZSGÁLAT
KALIBRÁCIÓS GÖRBE FELVÉTELE

42. 42
FELÜLETEK
Kalibrációs görbe felvétele
Kalibrációs görbe y = -0.2859x + 7.2672
R2
= 0.9574
0
1
2
3
4
5
6
0 5 10 15 20 25
TTD (h)
lgMPN/cella

43. 43
MIKROBASZÁM MEGHATÁROZÁSA

44. 44
FELÜLETEK
Mérési eredmények összehasonlítása
Felületek összcsíraszáma
0
1
2
3
4
5
6
7
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Mintavételi pont
lgN(cfu/100cm2
)
Lemezöntés Microtester

45. • Fertőtlenítőszerek
• Antibiotikumok
• Tartósítószerek
• Egyéb mikrobaszaporodást gátló anyagok
MIKROBA-PUSZTULÁSI ÉS
SZAPORODÁSGÁTLÁSI VIZSGÁLATOK

46. Antibiotikumok
MIKROBA-PUSZTULÁSI ÉS
SZAPORODÁSGÁTLÁSI VIZSGÁLATOK

47. ANTIBIOTIKUMOK
Doxycyclin y = 0.6571x + 0.4263
R2
= 0.9711
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
C (mg/ml)
lgTTD
Amoxicillin y = 0.1759x - 0.0754
R2
= 0.9949
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 1 2 3 4 5 6 7
C (mg/ml)
lgTTD
Enrofloxacin y = 48.348x + 0.2886
R2
= 0.9946
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025
C (mg/ml)
lgTTD

48. • Talajba került vegyszerek talaj-mikroflóra
aktivitását befolyásoló hatásának vizsgálata
– Például antibiotikumok hatása különböző típusú talajok
mikrobiális aktivitására
KÖRNYEZETVÉDELEM – BAKTÉRIUMOK
AKTIVITÁSÁNAK VIZSGÁLATA

49. 49
Doxycyclin, talaj
y = 8.8762x - 11.612
y = 6.5508x - 8.295
y = 4.4082x - 0.8414
y = 13.362x - 20.614
y = 2.0662x + 4.0359
0
5
10
15
20
25
2.0 2.5 3.0 3.5
lgc (mg/kg)
TTD(h)
T1 T2 T3 T4 T5
ANTIBIOTIKUM MIKROBA AKTIVITÁST CSÖKKENTŐ
HATÁSA KÜLÖNBÖZŐ TALAJOKBAN

50. 50
Talaj
Antibiotikum
Co (mg/kg)
Doxycyclin Enrofloxacin Linkomycin
T5
vulkanikus
9 57 15
T3
hordalék
18 - 57
T1
homok
52 35 19
T2
agyagos termőföld
70 47 41
T4
vályog
108 - 56
ANTIBIOTIKUMOK LEGKISEBB
SZAPORODÁS-GÁTLÓ KONCENTRÁCIÓI

51. 51
• Egyszerű mérési technika
• Nem igényel speciális mérőcellákat
• Nincs szükség szigorú hőmérséklet-szabályozásra
– 0,5 °C pontosságú laboratóriumi termosztátok alkalmasak
– (Az impedimetriás technika 0,002 °C pontosságú szabályozást igényel)
• Nincs szükség speciális táptalajokra
– Alkalmazhatóak a szabványos, illetve egyéb táptalajok
– (Az impedimetriás technika speciális tápleveseket igényel)
A MICROTESTER ELŐNYEI 1.

52. 52
• Nincs szükség a minta hígítására
– 100-108 cfu/mérőcella tartományban a minta hígítás nélkül mérhető
• Alkalmas membránszűréssel koncentrált, illetve
tamponos minták mikrobaszámának hígítás nélküli,
közvetlen meghatározására
– Egyetlen mérőcellába több membránszűrő is behelyezhető.
– Egyetlen mérőcella eredménye akár több liter mintát reprezentálhat
• Ásványvizek tétel-minősítése
• Vízügyi haváriák gyors kimutatása
• Direkt mérésnél eredmény általában néhány órán
belül
– Tenyésztéses vizsgálatok időigénye néhány nap
A MICROTESTER ELŐNYEI 2.

53. 53
• Gyors és egyszerű módszer a szaporodás- és
pusztulás-kinetikai, valamint táptalaj-optimalizálási
vizsgálatokhoz
• A módszer kellően szelektív
– Különös előnyt jelent, hogy a táptalaj szelektivitásán túl a redox-görbe
alakja is jellemző a szaporodó mikroba-csoportra.
– Ezt a szelektivitást a PCR technikán kívül egyéb módszerek nem érik el
A MICROTESTER ELŐNYEI 3.

54. 54
• A nagy mintamennyiségből kiinduló szelektív dúsítás
révén a MicroTester kiválóan alkalmazható a PCR-
technika elődúsító lépéseként
– A célmikrobát tartalmazó mikrobacsoportra negatív mintát nem
érdemes PCR-ral tovább vizsgálni
– A mikrobacsoportra pozitív dúsítás PCR-ral közvetlenül vizsgálható, a
mikrobaszám jelentősen meghaladja a 106/ml koncentrációt
– Csak a pozitivitás esélyével bíró minták kerülnek PCR vizsgálatra, ami
jelentős megtakarítást eredményez
• A minta-mennyiségre vonatkoztatott fajlagos vizsgálati
költség jelentősen alacsonyabb a tenyésztéses,
valamint az impedimetriás gyorsmódszerek
költségénél
A MICROTESTER ELŐNYEI 4.

55. 55
Köszönöm a figyelmet!
szk@aquilanet.hu