1. BIOTEKNOLOGI –
REKAYASA SEL –
JARINGAN
REKAYASA GENETIK DAN
TEKNIK TEKNIKNYA
Siti Julaiha / 0906597420
Pasca Sarjana
Teknologi Biomedis
Universitas Indonesia
BIOTEKNOLOGI –
REKAYASA SEL –
JARINGAN
REKAYASA GENETIK DAN
TEKNIK TEKNIKNYA
Siti Julaiha / 0906597420
Pasca Sarjana
Teknologi Biomedis
Universitas Indonesia
Pasca Sarjana Teknologi Biomedis
Universitas Indonesia
[Mei 2010]
2. Apa itu Gen?
Gen - subunit pekerja dari DNA.
DNA --- > database informasi kimia instruksi membuat
protein
DNA- dua pasang rantai heliks ganda
Blok base DNA : Adenin, Timin, Sitosin, dan Guanin.
1 SEL = 46 molekul DNA untai ganda.
1 MOLEKUL DNA = 50-250000000 basis pada kromosom.
DNA --- messenger RNA (mRNA) keluar
nukleus menuju ke sitoplasma =pada
ribosom, -- molekul protein
GENETIK
3. Gen-membawa kunci untuk kesamaan kita dan
warisan keunikan;
KERUSAKAN GEN >>> cacat dan penyakit,
bahkan kematian
GENETIK
4. Sel manusia .== 2 set kromosom, dari ibu dan
ayah.
Tiap set = 23 kromosom tunggal = 22 autosom
dan kromosom X atau Y seks.. (Wanita mewarisi
X dari orang tua masing-masing, sementara laki-
laki mendapat X dari ibu dan Y dari ayah.)
GEN = STRUKTUR DAN BENTUK PROTEIN
-- BENTUK DAN FUNGSI SEL
GENETIK
5. Bagaimana cara kerja gen?
GEN - PROTEIN = FUNGSI DASAR , GEN
HOUSEKEEPING >> AKTIF DI BERBAGAI SEL
GEN TIDAK AKTIF HAMPIR SEPANJANGN
WAKTU
GEN HANYA BERFUNGSI PADA AWAL
EMBRIO
GEN PROTEIN UNIK KARAKTER UNIK SEL
GEN MUTASI,
KERUSAKAN Lebih
dari 4.000 penyakit
GENETIK
6. MUTASI GEN :
-BASE MERUBAH BASE DNA (misspelling)
-KEHILANGAN ATAU KELEBIHAN BASE
-TIDAK TERLIHAT (SILENT) STRUKTUR,
FUNGSI TIDAK PENGARUH
- MUTASI LAIN
PERUBAHAN PROTEIN STRUKTUR DAN
FUNGSI (CACAT HAEMOGLOBIN SICKLE
CELL ANEMIA)
HILANG FUNGSI PROTEIN TOTAL
MUTASI GENETIK
7. MUTASI BERBEDA PADA GEN YANG
SAMA
MENGHASILKAN EFEK BERBEDA
CONTOH PROUKSI GEN MUCUS 300
MUTASI GEN BEBERAPA SIMPTOM
BERAT,
BEBERAPA SIMPTON MENENGAH,
TIDAK ADA SIMPTON SAMA SEKALI
MUTASI GENETIK
8. MUTASI GERMLINE :
WARISAN ORANG TUA PERUBAHAN GEN
PADA SEL REPRODUKSI AWAL
PEMBELAHAN SEL AKUMULASI DNA
SEMUA SEL TUBUH DITURUNKAN
ACQUIRED MUTASI / MUTASI SOMATIK:
MUTASI DNA KESALAHAN GEN PADA SEL
TERTENTU BERKEMBANG SAAT HIDUP
KESALAHAN SAAT PEMBELAHAN SEL
DAMPAK LINGKUNGGAN (RADIASI, RACUN)
PERUBAHAN DNA SEL INDIVIDU
MUTASI GENETIK
9. GANGGUAN GEN
RESESIF
KEDUA ORANG TUA
FREE DESEASE
SATU ALEL
NORMAL, SATU MUTASI
ALEL DITURUNKAN
PROBABILITAS ANAK
¼ DUA MUTASI ALEL /
AFFECTED,
½ SEL NORMAL DAN
ALEL / CARRIER,
¼ ALEL NORMAL
GANGGUAN GEN
DOMINAN SALAH
SATU ORANG TUA
ALEL PENYEBAB
PENYAKIT DOMINASI
SEL NORMAL 50%
PROBABILITAS
DITURUNKAAN PADA
SETIAP ANAK
MUTASI GENETIK
10. SEJARAH
Jack Williamson’s Science Fiction Novel
Dragon Island, 1951, ISTILAH GENETIC
ENGINEERING
1952 JAMES WATSON, FRANCIS CRICK
STRUKTUR DAN FUNGSI DNA
Rekayasa Genetic 1960’an TEKNIK
LABORATORIUM MERUBAH DNA
ORGANISME HIDUP
REKAYASA GENETIK
11. REKAYASA GENETIK
GOAL
Menyisipkan gen ke spesies lainnya
Mengisolasi gen tertentu
Memproduksi RNA yang diinginkan
atau molekul protein
Membentuk organisme transgenik
Merubah gen perubahan produk
gen
Merubah ekspresi gen
memberikan informasi dan
aplikasi lain
Mengkoreksi cacat gen pada
organisme komplek
Meningkatkan efisiensi produksi
enzim dan obat
12. TEKNIK REKAYASA
GENETIK
REKAYASA GENETIK
TEKNOLOGI REKOMBINAN DNA
PENGUBAHAN GEN
GENETIK MODIFIKASI ORGANISM
(GMO) GENOME TIPE BARU
METODE REKOMBINASI DNA :
PENGGUNAAN BIOLOGIS VEKTOR
(PLASMID/VIRUS)
13. TEKNIK REKOMBINASI DNA
1. MEMOTONG RANTAI PANJANG DNA
MENJADI FRAGMEN YANG LEBIH
KECIL DENGAN ENZIM RESTRIKSI
DAN MEMISAHKAN DENGAN GEL
ELEKTROPHORESIS
(PEMOTONGAN-PEMETAAN DNA)
2. ISOLASI, MEMPERBANYAK/
AMPLIFIKASI, DAN MEMURNIKAN
FRAGMEN MELALUI MOLEKUL
CLONING
(MENYISIPKAN GEN KE VEKTOR,
MENYISIPKAN VEKTOR KE HOST),
REPLIKASI, MULTIFIKASI)
9-13
DIGUNAKAN UNTUK MELAKSANAKAN
LIMA OPERASI DASAR DALAM
REKAYASA GENETIK YAITU
14. 3. MENGGUNAKAN FRAGMEN DNA
YANG TELAH DIMURNIKAN SEBAGAI
PROBE HIBRIDISASI UNTUK
MENGIDENTIFIKASI SUSUNAN
YANG SERUPA PADA LIBRARIES
CLONE ATAU MIXED MOLEKUL DNA
DAN RNA
(HIBRIDISASI , PROBE, LIBRARIES)
4. MENGISOLASI SECARA CEPAT DAN
MEMPERBANYAK GENOME ATAU
SUSUNAN mRNA YANG TELAH
DITENTUKAN SEBELUMNYA
MELALUI POLYMERASE CHAIN
REACTION(PCR)
(PRODUKSI GEN)
5. MENENTUKAN SUSUNAN BASE
YANG TEPAT DENGAN
MENGISOLASI FRAGMEN DNA
(ISOLASI FRAGMEN DNA)9-14
TEKNIK REKOMBINASI DNA
15. E. coli is the most widely used cloning host for amplification
of recombinant DNA
http://www.bmb.psu.edu/courses/micro106/biotech/biotechover.jpg
TEKNIK REKOMBINASI DNA
17. Plasmids adalah potongan-potongan
lingkaran genetik pada bakteri yang memiliki
kemampuan untuk melewati batas spesies.
Lingkaran dapat dipecah dan materi genetik
baru ditambahkan dan menempatkan materi
genetik baru terhadap gen bakteri itu sendiri.
Virus juga dapat bertindak sebagai vektor
dalam rekayasa genetika. Virus adalah partikel
yang menular berisi materi genetik yang
dapat dikombinasikan dengan sebuah gen
baru. Virus ini dapat membawa gen baru ke
dalam sel penerima dalam proses menginfeksi
sel tersebut. Juga dapat dinonaktifkan
sehingga saat membawa gen baru ke dalam
sel, virus tidak dapat menjalankan mesin
genetik sel untuk membuat ribuan salinan itu
sendiri.
PLASMID/VEKTOR
18. VECTORS PEMBAWA GEN
Jenis Jenis Vektor diantaranya :.
retroviruses
adenoviruses
adeno-associated viruses (AAV)
herpes simplex virus
rhinoviruses
Human Immunodeficiency Virus (HIV)
pBR322 and pUC plasmids
phage lambda , untai tunggal DNA
phages (berguna karena susunan DNA
dibawa pada untai tunggal DNA pada
Metode Sanger)
cosmids (hybrids dari phage lambda
dan plasmids, sangat berguna karena
digunakan untuk menyisipkan fragmen
DNA yang relatif besar pada sel host
PLASMID/VEKTOR
19. Vektor mengatasi masalah tidak berlangsungnya
replikasi kerena memiliki sifat :
•Cukup besar untuk membawa terus gen yang
diinginkan
•Namun cukup kecil untuk mengalami degradasi
saat purifikasi atau proses pemurnian.
•Bentuk sirkular/ lingkaran (atau lebih tepatnya
loop tertutup), mengurangi faktorkerusakan
•Memiliki sifat replikasi alam sehingga DNA
endogenote dapat direplikasi dengan sel host.
•mengandung susunan pengendali, seperti
promotor transkripsi sehingga gen akan
direplikasi atau diekspresikan.
•Memiliki beberapa site restriksi unik sehingga
vektor DNA akan terpotong pada lokasi yang
diinginkan, dan beberapa lokasi untuk
menyisipkan DNA asing
•Mengandung Gen Marker/Penanda, seperti gen
resitansi antibiotik, yang dapat mengidentifikasi
sel-sel vektor untuk menganalisa proses
transformasi.
PLASMID/VEKTOR
20. EUKARIOTIK VEKTOR DIGUNAKAN :
• DNA plasmid dan vektor bakteri tidak
cukup memadai.
•E. coli tidak memiliki beberapa sistem
enzim perubahan post-transcriptional/
post-translational protein.
•Studi fungsi genom eukariotik in vivo
•Bidang kesehatan dan pertimbangan
ekonomi
EUKARYOTIC VECTORS
21. VEKTOR KHUSUS UNTUK HEWAN
Virus tumor DNA SV40 (Virus
monyet vacuolating virus) -
mengubah sel-sel eukariota normal
menjadi sel kanker.
SV40 membawa DNA asing.
Dapat direplikasi dalam sel-sel
eukariotik untuk kloning DNA
Virus lain dengan afinitas sel-sel
hewan
EUKARYOTIC VECTORS
22. VEKTOR KHUSUS UNTUK TANAMAN
Bakteri tanah Agrobacterium
tumefaciens dikenal penyebab tumor
tumbuhan dikotil empedu.
Agen penyebab tumor plasmid Ti,
mengubah sel tanaman normal
menjadi sel kanker saat integrasi ke
DNA tanaman.
(Petunjuk vektor yang baik!!).
Genetika DNA asing ke plasmid,
afinitas DNA tanaman dikotil untuk
memfasilitasi penyisipan gen baru ke
dalam tanaman.
EUKARYOTIC VECTORS
23. PEMOTONGAN DNA
•PEMOTONGAN DNA PADA BASE SPESIFIK
•PEMOTONGAN DENGAN ENZIM RETRIKSI
YANG SAMA (ENZIM EX EcoR1, HANYA
MEMOTONG PADA BASE SPESIFIK, 4-8
PASANG BASE)
•DNA FRAGMEN RESTRIKSI
•STICKE END ANNEAL KE DNA LAIN DENGAN
PASANGAN BASE KOMPLEMENTER
Pemotongan gen dengan menggunakan
RESTRIKSI ENDONUKLEASE
28. DNA plasmid / vektor sisipan (produk
PCR) menggunakan enzim polimerase
Taq ,
Menambahkan Adenin (A) yang
mengantung pada ujung 3‘
Pemotongan secara tumpul
Penambahan ujung T yang menggantung
dengan jalan mereaksikan ujung 3‘ DNA
yang tumpul dengan dTTP menggunakan
katalisator enzim polimerase Taq.
Eisiensi proses ligasi DNA ujung tumpul
tidak sebaik ujung kohesif dan lebih sulit
dalam memperoleh plasmid rekombinasi.
Pemotongan gen dengan menggunakan
Kloning TA
PEMOTONGAN DNA
30. PEMOTONGAN DNA
DNA UNTAI TUNGGAL DENGAN ENZIM
REVERSE TRANSKRIPSI mRNA DIKONVERSI
ENZIM DNA POLYMERASI UNTAI GANDA /
KOMPLEMENTARI DNA DISEBUT cDNA
Reverse transkripsi
primed dari poly-A
ditemukan pada hampir
semua eukaryotic mRNAs
Banyak variasi membuat
rantai DNA kedua
Rantai diciptakan
menggunakan enzim
kedua yang diprime kan
melalui generasi Hairpin
DNA dengan reverse
transkripsi
Pemotongan gen dengan menggunakan
Reverse Transkripsi
31. Pemetaan restriksi disimpulkan dari pemotongan
fragmen DNA dengan dua enzim, menyediakan alur
peta fragmen DNA dan Genome Virus
Langkah untuk menentukan susunan
site restriksi sepanjang fragmen DNA:
Pembagian pemurnian untuk cloned DNA
menjadi tiga bagian/aliquots
Potong satu aliquot dengan EcoRI, satu
dengan with BamHI, dan yang ketiga
dengan kedua enzim
Pisahkan fragmen dengan Gel
Electrophoresis
Tentukan ukuran dengan perbandingan
pada ukuran standar
Gunakan proses eliminasi untuk
menghasilkan hanya susunan yang dapat
menghitung ukuran fragmen yang didapat
pada ketiga aliquot
9-31
Restriction mapping
PEMETAAN DNA
33. Gel electrophoresis dan Blotting adalah teknik
analisa yang umum digunakan untuk pemetaan DNA
fragments
Southern blot
adalah metode penting untuk mengisolasi dan
menguji Klone DNA
9-33
PEMETAAN DNA
SOUTHERN BLOT
mRNA memiliki sedikit introns, ada
wilayah komplementer dari gen, probe
bekerja, bahkan jika intron membentuk
"outloopings" pada hibrida probe-DNA..
Penggunaan autoradiograf untuk
pengambilan gambar pada film ini yang
dibentuk oleh paparan pada suatu
radioaktivitas.
Northern Blot :untuk menguji RNA
Western Blot :untuk menguji protein
melalui pengikatan antibody
34. Langkah langkahnya sebagai berikut :
•Potong seluruh Gen DNA dengan enzim
restriksi
•Pisahkan fragmen DNA fragments
dengan Electrophoresis.
•Blot fragment DNA terhadap filter.
•Hybridisasi DNA ke probe.
•Amati band/rantai yang sesuai dengan
Autoradiograph atau Fluorescence.
PEMETAAN DNA
SOUTHERN BLOT
36. Metode transfer gen langsung melibatkan
pembentukan pori-pori atau lubang membran
sel untuk masuknya gen baru.
Dilakukan dengan :
-Bathing sel larutan kimia khusus / Bahan kimia
poration
-Pengarahan sel sel kepada arus listrik lemah
yang disebut Elektroporasi.
Berdasarkan :
- Perbedaan ukuran molekul
-Perbedaan sifat perpindahan Kimia /listrik
Fragmen DNA bermigrasi ke arah kutub positif
(sugar phospate backbone adalah bermuatan
negatif).
Jarak Migrasi berbanding terbalik dengan
logaritma dari panjang fragmen (dalam basis
pasangan).
ELECTROPHORESIS
PEMETAAN DNA
37. Elektrophoresis ada dua jenis
Polyacrylamide gels
Agarose gels
Polyacrylamide Gels
Memisahkan fragmen DNA hingga
1000 bp long
Kekuatan penyelesaian yang lebih
tinggi dibanding agarose
Memisahkan fragmen yang berbeda
pada single nucleotide panjang
Agarose Gels
Memisahkan campuran fragmen up
to 20 kb
Mudah disiapkan
Memiliki Resolusi yang lebih rendah
ELECTROPHORESIS
PEMETAAN DNA
38. Agarose Gel Electrophoresis
Polimer Karbohidrat dimurnikan dari air garam algae
Kopolimer dari mannose dan galactose
Melebur dan mendingin menjadi bentuk gel dengan
variasi ukuran lubang/pore
Overall kecepatan konsentrasi agarose :Pulsed-field gel
electrophoresis
Migrasi DNA - Negative charged phosphate backbone
size DNA fragments- compared to standard
Pemitaan gel divisualisasikan dengan sumber cahaya UV
central dye Ethidium Bromide
Fluorescent under UV light
ELECTROPHORESIS
PEMETAAN DNA
43. PENYISIPAN GENE KE
VEKTOR
- Duplikasi gen hasil pada langkah
sebelumnya.
-Gen dimasukkan dalam organisme lain/
vector untuk menghasilkan rancangan
yang telah ditetapkan.
-Fragmen DNA dimasukkan ke Plasmid
menggunakan restriksi dan enzim liase.
-Enzim restriksi (PstI), memotong plasmid
pada bagian tengah salah satu dari marker
gen.
-DNA asing anneal dengan plasmid dan
bergabung kovalen oleh DNA ligase
membentuk vektor hibrida (hibrida DNA
bakteri-DNA asing).
44. Produk lain :
-Plasmid reanneal membentuk plasmid
asli,
-Fragmen DNA bergabung membentuk
rantai
Produk berbeda dipisahkan dengan gen
penanda, dan mengidentifikasi vektor
hibrida.
PENYISIPAN GENE KE
VEKTOR
49. PELAPISAN REPLIKASI
Teknik sederhana membuat salinan piring agar.
Pad kain steril ukuran yang sama sebagai pelat
ditekan pada permukaan pelat agar dengan
bakteri yang tumbuh di atasnya.
Beberapa sel koloni akan menempel pada
kain. Jika kain tersebut kemudian ditekan ke
piringan agar-agar baru, beberapa sel akan
tertanam dan koloni tumbuh dalam posisi yang
sama persis pada pelat baru.
51. Untuk membedakan sel-sel yang telah
mengambil vektor plasmid hibrida
(dengan gen asing di dalamnya) dari sel-sel
yang telah mengambil plasmid tanpa gen
Gen penanda/marker (ketahanan terhadap
ampisilin).
Gen asing dimasukkan ke gen marker,
Produk gen yang tidak tepat.
Sel-sel dengan plasmid hibrida dibunuh
ampisilin, sel-sel dengan plasmid normal
kebal terhadap ampisilin.
Koloni sel berisi plasmid vektor hibrida
teridentifikasi, dapat dipilih dan ditanam
pada piring lain.
Teknik replikasi ini dijabarkan pada
metod Hibridasasi dan Probe yang
disiapkan dari kumpulan fragmen DNA
PELAPISAN REPLIKASI
52. Mendeteksi susunan RNA atau DNA yang
spesifik pada sampel biologis
DNA dan RNA , 4 nucleotide bases : CGAT(U)
C G A T
G C T A
Target gene
Probe Base
Nukleotida
Komplementari
CTTAGGTCAGTAA
GAATCCAGTCATT
HYBRID
Hybridisasi ; Reaksi kimia antara probe dan DNA
atau RNA yang akan dideteksi
PRINSIP HYBRIDISASI
HIBRIDISASI - PROBE
53. Hybridisasi digunakan untuk
mengidentifikasi susunan DNA yang
serupa
NORMAL HYBRIDIZATION
• Ekstrasi dan isolasi DNA atau RNA
• Penghancuran DNA dengan enzim
restriksi
• Pemisahannya pada Gel
• Blotting pada nitrocellulose
• Probing dengan susunan komplementar
Prinsip dasar pada hibridisasi in situ
serupa, kecuali probe diutilisasikan untuk
mendeteksi susunan nukleotida yang
spesifik pada sel dan jaringan.
HIBRIDISASI - PROBE
54. HIBRIDISASI - PROBE
IN-SITU HYBRIDIZATION (ISH)
Tipe hibridisasi yang menggunakan Rantai
Komplementari DNA atau RNA yang berlabel
(ex. probe) untuk melokalisasi susunan mRNA
atau DNA yang spesifik pada bagian morfologis
yang diawetkan dari bagian jaringan akutal,
persiapan sel atau kromoson yang terisolasi,
atau jika jaringan cukup kecil (misalnya bibit
tanaman, embrio Drosophila) pada seluruh
jaringan ( seluruh ISH)
-Dengan hibridasasi rantai komplementari dari
probe nukleotida pada susunan yang diinginkan
-ISH memungkinkan visualisasi pada :
-autoradiographic in-situ hybridization (35
S, 32
P)
-Fluorescence in-situ hybridization (FITC dye)
-enzymatic in-situ hybridization (biotin,
digoxigenin
55. Autoradiografi In situ Hibridisasi
Prinsip : setiap base nukleotida mengikat
setiap base nukleotida komplementari
Pengikatan spesifik Probe DNA label pada
susunan komplementari sampel jaringan diikuti
visualisasi Probe
Deteksi susunan spesifik nukleotida
DNA (Northern blotting),
RNA (Southern Blotting)
UCCAAUGGCUUAUUUCCCUA
5’ 3’transcripts
RNA
Radiolabelled-RNA
RNAprobes-DNA - stable hybrids
RNAprobes-RNA – stable hybrids
HIBRIDISASI - PROBE
57. Sebuah PROBE genetika adalah fragmen
asam nukleat yang berlabel radioaktif.
Urutan fragmen asam nukleat dari
susunan yang diketahui dapat
memungkinkan lokasi yang tepat dari
susunan DNA tertentu pada untai
tunggal DNA yang tidak diketahui (rantai
tunggal terjadi karena denaturasi buatan
melalui panas, dll) sampel dengan
hibridisasi padanya.
HIBRIDISASI - PROBE
58. Berikut adalah salah satu cara membuat Probe
Berlabel:
1. Memillih produk protein yang diinginkan, dan
menentukan urutan aa.
2. Dari urutan aa , kemudian urutan mRNA dapat
diekstrapolasi, dan mRNA diisolasi
3. Menggunakan reverse transcripsi untuk
memproduksi DNA dari mRNA terisolasi
4. Supply radioaktif nukleotida (biasanya dilabeli
dengan 32P) sebagai bahan baku untuk sintesis
5. Proses Denaturasi hybrid DNA-RNA asam
nukleat dan didapatkan rantai tunggal, probe
DNA radioaktif yang akan berikatan dengan
DNA yang dikodekan untuk mRNA Anda
awalnya terisolasi
6.Lakukan proses Klon
HIBRIDISASI - PROBE
59. HIBRIDISASI - PROBE
REVERSE GENETICS
Radioactive klone sebagai Probe untuk
gen yang relevan.
Sisipan susunan mutasi ke gen bakteri
untuk menentukan fungsi gen
terganggu, karena bakteri tidak dapat
memproduksi produk gen terganggu/
disrupted gene. (gen eukaryote
disisipkan pada bakteri selalu
mengekspresikan (dalam keadaan wild
type atau mutant), bakteri tidak memiliki
sekuens gen eukariotik yang akan
mengaktifkan/menonaktifkannya).
Teknologi ini penting dalam GENE
KNOCKOUT.
Rekayasa gen bakteri (dan fungi) ini
digunakan untuk memproduksi produk
gen eukaryotic pada jumlah yang besar
gene--a commercial boon!
63. Pustaka adalah kumpulan dari fragmen
fragmen yang telah di klon.
Langkah mengumpulkan pustaka genome
Lengkapi pustaki genome dengan
mengumpulkan klon klon yang
mengandung satu kopi dari setiap
susunan pada semua genom
Ekuivalen Genom – jumlah klon klaon
pada pustaka yang sempurna
Bagi panjang genome dengan rata rata
ukuran sisipan yang dibawa oleh vektor
pustaka.
Peneliti biasanya membuat pustaka
dengan empat atau lima ekuivalen
geneome untuk probabilitas 95% yang
setiap lokus ditampilkan paling sedikit
satu kali.
9-63
PUSTAKA
64. DNA LIBRARIES
Perpustakaan DNA sebagai satu buku kompilasi
informasi yang besar.
Setiap organisme memiliki genom,.
PERPUSTAKAAN DNA , kumpulan fragmen
restriksi kloning dari genom organism tunggal.
Tujuannya untuk memiliki perpustakaan berisi
klon geln SEMUA organisme. tapi semua
perpustakaan DNA lengkap.
Genomik PERPUSTAKAAN berisi DNA genom
lengkap suatu organisme, dalam bentuk fragmen
DNA kecil/oligonucleotides mewakili gen
dikenal.
Bidang bioinformatika melibatkan penggunaan
komputer untuk menganalisis dan menyimpan
data genetik, seperti perpustakaan DNA dari
spesies tertentu.
cDNA PERPUSTAKAAN adalah library DNA dari
klon DNA direkonstruksi (menggunakan reverse
transcriptase) beberapa molekul organisme
68. dibuat dengan vektor kloning mengandung unsur
teratur dibutuhkan ekspresi gen, seperti wilayah
promotor.
Dalam vektor ekspresi E. coli, merupakan
promotor berada di samping daerah unik
restriksi tempat DNA diinginkan dapat disisipkan.
Jika berhasil, penyisipan gen asing ke dalam
kerangka baca yang benar akan menghasilkan
transkrip gen &diterjemahkan sel inang E. coli.
Blotting dan perlakuan kultur memungkinkan
protein diinginkan tetap difilter nitroselulosa.
Antibodi yang diiketahui, dilabelkan radioaktif,
dicuci ke saringan dan dibiarkan glom ke protein
yang diinginkan.
Antibodi yang tidak terikat kemudian dibilas
Filter diatur di atas film radiografi, dan diberi
label koloni yang terungkap.
Kembali ke piring asli, ambil sedikit klon yang
membawa gen interest yang telah disisipkan ,dan
lakukan replikasi
EXPRESSION LIBRARIES
70. Pustaka cDNA membawa informasi dari
Transkrip TNA pada jaringan tertentu.
Semua Pustaka genom mengandung
semua DNA pada genom.
Pustka cDNA mengandung hanya
informasi dari gene’s exons.
Lankah langkahnya :
Siapkan total mRNA dari jaringan
Tambahkan reverse transcriptase
Untuk memulai sintesa, tambahkan empat
hal berikut
deoxyribose
nucleotide
triphosphates, dan
primers9-70
PUSTAKA cDNA
74. MULTIPLIKASI DNA
Multiplikasi DNA memungkinkan
untuk menumbuhkan fragmen DNA dalam
jumlah besar yang merupakan DNA Clone
yang diinginkan. Fermentor skala besar
oleh cloning ini memiliki semua genetik
identik karena reproduksi aseksual.
Jumlah cloned DNA yang besar,
memerlukan proses karakterisasi, metode
diantaranya :
•Karakterisasi Susunan dengan DNA
Sekuensi (Metode Sanger), Gene Fungsi,
PCR
•Modifikasi yang diinginkan
•Penyisipan pada organisme host
75. DNA klone yang diinginkan telah ditumbuhkan
tetapi urutan atau susunan basenya tidak
diketahui,
Maka Ditentukan urutan kloning fragmen DNA
dengan berbagai metode sekuensing DNA,
diantaranya :
Metode dideoksi
Ide Utama:
Setelah proses pengikatan dideoksi selesai,
maka metode Sanger sequencing gel (melalui
elektroforesis) dilakukan. Sejumlah besar
fragmen DNA, masing-masing satu nukleotida
lebih panjang dari yang terakhir. Urutan
nukleotida pada dasarnya dapat dibaca
langsung dari gel tersebut.
MULTIPLIKASI DNA
DNA SEKUENSI
76. Dideoksi nukleotida menyebabkan penghentian proses
perpanjangan rantai selama replikasi DNA. Konfigurasi
Dideoksi primer kekurangan group 3’-OH yang dibutuhkan
untuk perpanjangan rantai pada konfigurasi primer.
DNA SEKUENSI
77. Step pertama metode Dideoksi: Asteris/dideoksinukleotida.
DNA disekuensi ditempatkan pada konfigurasi
primer(a,b).4 reaksi campuran diciptakan, reaksi dengan 4
normal nukleotida plus 1 dideoksinukleotida. Sintesis DNA
eaksi campuran berhenti saat complement
dideoksinukleotida muncul template (c ).
DNA SEKUENSI
78. Elektroporesis produk segmen dilakukan dengan metode dideoksi DNA sekuensi
memungkinkan pembacaan langsung susunan DNA. Asterisk/dideoksinukleotida.
Reaksi sintesa produkdiisolasi dengan penghilangan primer dan template. Setiap
reaksi campuran (contoh :ddTT adalah campuran mengandung dideoksitimin)
menghasilkan produk spesifik terhadap panjang yang dapat ditentukan dengan
elektroporesis. Pada kasus campuran ddTTP, Kedua ujung framen berhenti pada
Timin adalah mungkin, satu dengan panjang dua base, dan satunya dengan panjang
tujuh base. Kemudian komplemen dari timin, adenine, muncul pada posisi 2 dan 7
pada DNA asli. Namun, baik pada untai asli atau komplemen (sintesa baru)
memberikan susunan original karena DNA adalah double helix yang susunannya pada
satu rantai tunggal didefinisikan oleh susunan komplementari rantai lainnya.
DNA SEKUENSI
79. Semua proyek sekuensing menggunakan
protokol dasar yang sama.
Urutan ditentukan sekitar 800 basis
pada suatu waktu.
Metode Maxim-Gilbert
Kimia pembelahan DNA pada jenis
nukleotida yang spesifik
Metode Sanger
Perpanjangan enzimatis DNA untuk
menentukan penghentian duplikasi base
Metode ini sangat popular dan efisien,
terutama untuk metode automasi
Kedua teknik menghasilkan keakuratan
kira kira 99.9%
9-79
DNA SEKUENSI
86. Susunan Daerah Panjang DNA
Primer walking
Susunan dimulai dari kedua ujung klone
yang disisipkan
Primer baru didapat dari susunan pada
round sebelumnya
9-86
Shotgun sequencing
Susunan panjang DNA
di potong menjadi
fragmen kecil yang
masing masing akan
diklone
Semua susunan
fragmen kecil
ditentukan
Fragmen kecil
diselaraskan oleh
komputer untuk
menghasilkan satu
urutan kontinu
panjang
DNA SEKUENSI
87. Pendekatan Susunan Shotgun
bergantung pada redundansi.
- Harus mengumpulkan urutan informasi 3-4
kali jumlah sebenarnya Pasangan basa dari klon
asli untuk cakupan penuh
- Kadang-kadang harus mengisi kekosongan
dengan primer walking
- Harus memiliki banyak otomatis sequencer
- Sangat cepat jika laboratorium memiliki
peralatan cukup
Primer Walking
- Tidak memerlukan redundansi
- Tidak memerlukan penyelarasan
- Lebih lambat dari sekuensing shotgun karena
harus membuat primer setelah setiap putaran
urutan
- Bekerja dengan baik di dalam laboratorium
tanpa sejumlah besar sequencers otomatis
9-87
Susunan DNA Cepat/Rapid
DNA SEKUENSI
88. Polymerase chain reaction untuk
mengisolasi fragmen DNA secara cepat
PCR (polymerase chain reaction)
mencapai akumulasi eksponensial dari
target DNA
Berdasarkan urutan DNA yang telah
ditentukan sebelumnya,
oligonucleotides pendek (~ 20bp)
dikembangkan dan dilengkapi
untuk menyusun DNA target yang
diapit .
Oligonucleotides bertindak sebagai
primers untuk menyalin DNA yang
serupa (Replikasi DNA).
9-88
MULTIPLIKASI DNA
REAKSI RANTAI POLIMER (PCR)
93. PCR juga dapat digunakan untuk
bermacam fungsi seperti :
Pemetaan Genetic
Mendeteksi tipe Geno
Analisa jejak kerusakan sebagian
DNA
Studi Evolutionari
Bandingkan susunan homologous dari
organmisma yang berhubungan
Bandingkan susunan dari variasi
sumber
Studi keanekaragaman gene
Diagnosa Penyakit Menular
BEBERAPA CONTOH PCR
DIPAPARKAN SEBAGAI BERIKUT:
9-93
REAKSI RANTAI POLIMER
94. metode sensitif
mendeteksi dan
menganalisa transkripsi
mRNA/RNA pada porsi
yang rendah
RNA tidak dapat digunakan
sebagai template PCR,
sehingga harus
ditranskripsikan
menjadi cDNA dengan
reverse transcriptase
dari Moloney murine
virus atau
Avian virus, duplikat cDNA
kemudian diperbanyak.
Teknik diawali
pencampuran mixing
short (12-18 base)
polymers thymidine
(oligo dT) dengan
mRNA, dan anneal
RNA's polyadenylate
tail. Reverse transcriptase
ditambahkan dan oligo
dT sebagai primer
Roche Molecular Biochemicals: PCR Application Manual. RT-PCRRoche Molecular Biochemicals: PCR Application Manual. RT-PCR
Reverse Transcriptase-PCR
REAKSI RANTAI POLIMER
95. (PCR based) dengan Turunan
primer (mutagenesis saturasi)
REAKSI RANTAI POLIMER
103. (PCR based) dengan Error – Prone
PCR dengan ketelitian yang
rendah!
Dicapai dengan:
- Peningkatan konsentrasi ion
Mg2 +
- Penambahan Mn2 +
- Konsentrasi yang tidak sama
pada keempat dNTPs
- Penggunaan dITP
- Meningkatkan jumlah Taq
polimerase (Polymerase tanpa
bukti fungsi pembacaan)
REAKSI RANTAI POLIMER
Menentukan varians baru protein
Berdasarkan prinsip bahwa Taq Polymerase dapat
berannealing pada pasangan base yang tidak kompatibel
satu sama lain selama proses amplifikasi / penguatan
dalam kondisi PCR yang tidak sempurna.
115. Transfeksi Stable dan transient
Suffisien atau memadai jika gen
ditransfeksikan hanya ekspresi
sementara/transient.
Bila DNA diperkenalkan dalam proses
transfeksi biasanya tidak dimasukkan ke
dalam inti genom, DNA asing hilang
pada tahap berikutnya, ketika sel
mengalami mitosis.
Transfeksi stabil >> gen transfeksi
tertinggal pada sel genome dan sel sel
keturunannya.
Ko-transfeksi pada gen lain memberikan
keuntungan sel seleksi, seperti resistensi
terhadap racun tertentu.
116. Transfeksi Stable dan transient
Sel transfeksi memasukkan bahan
genetik asing ke dalam genom mereka.
Toksin menuju ke arah gen ko-
transfeksi menawarkan perlawanan,
kemudian ditambah kan ke kultur sel,
hanya beberapa sel dengan gen asing
disisipkan ke genom mereka akan dapat
berkembang biak, sedangkan sel lain
akan mati.
Setelah menerapkan seleksi tekanan ini
selama beberapa waktu, hanya sel-sel
dengan transfeksi stabil bertahan dan
dapat dibudidayakan lebih lanjut.
Bahan kimia agen yang umum
digunakan untuk transfeksi stabil adalah
Geneticin / G418, yang merupakan racun
yang bisa dinetralisir oleh produk
resistansi gen neomisin (neo gen ).
124. ELECTROPORASI
Phonophoresis
(Sonophoresis)
Pulsa Ultrasoundare passed
melalui probe ke permukaan ,
memfluidakan lapisan lemak
dengan pembentukan
gelembung yang disebabkan
kavitasi
Menggunakan energi Ultrasound agar penetrasi pada
substansi aktif meningkat
Efek utamanya adalah pembentukan dan subsekuensi
ancurnya gelembung gas pada larutan yang disebut
Kavitasi
Efek pemanasan meningkatkan fluiditas dan difusivitas
molekul melalui penghalang
Ultrasound dapat mendorong partikel melalui nya
dengan meningkatkan tekanan walaupun hanya sedikit
125. ELECTROPORASI
Iontophoresis
(Electrophoresis
)Arus mengalir antara elektroda
aktif dan elektroda indifferent
electrode repelling drug away
dari aktif elektroda dan
memasuki permukaan
Menggunakan aliran listrik kecil
Menyediakan driving force untuk dapat memulai
penerasi dengan menCharge- mengalirkan arus molekul
pada permukaan
Terdiri dari dua elektroda, aktif elektroda dnegan
penetrat charged yang sama dan posisi elektroda positif
dimanapun
Efektif terutama untuk mengalirkan aris ke molekul
dan molekul kecih yang mempunyai masa jenis kurang
dari 5,000 daltons
126. ElectroporationElectroporation
Menggunakan tegangan tinggi 30~1,000V (dengan
tujuan aestetik, terbatas apada 50V untuk periode
pendek (10µs to 100ms) berlawanan dengan iontophoresis
yang menggunakan tegangan rendah.
Membuat pore hidrofilik transient (aqueous pathways)
(Electropore bervariasi ukuran dari 40-250µm)
Memungkinkan lewatnya molekul makro melalui
kombinasi difusi , elektrophoresis dan elektroosmosis
Efektif untuk charged, neutral dan molekul natural
serta molekul besar bermasa jenis lebih dari 40,000
ELECTROPORASI
![BIOTEKNOLOGI –
REKAYASA SEL –
JARINGAN
REKAYASA GENETIK DAN
TEKNIK TEKNIKNYA
Siti Julaiha / 0906597420
Pasca Sarjana
Teknologi Biomedis
Universitas Indonesia
BIOTEKNOLOGI –
REKAYASA SEL –
JARINGAN
REKAYASA GENETIK DAN
TEKNIK TEKNIKNYA
Siti Julaiha / 0906597420
Pasca Sarjana
Teknologi Biomedis
Universitas Indonesia
Pasca Sarjana Teknologi Biomedis
Universitas Indonesia
[Mei 2010]](https://image.slidesharecdn.com/rekayasagenetikdanteknik-sitijulaiha-111226105717-phpapp01/85/rekayasa-genetik-dan-teknik-1-320.jpg)
